检索结果-内蒙古大学图书馆

免疫学杂志 2016年第12期32卷 1073-1077页

作者：高雅倩高雅倩段跃强邢丽杨鹏辉王希良安徽医科大学 230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室 100071

目的以冷适应、减毒流感活疫苗株为载体,构建并拯救喷鼻重组HAd V疫苗候选株,并评价其免疫效果,为腺病毒候选疫苗研制提供实验数据。方法应用反向遗传学技术,以冷适应、减毒流感活疫苗A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)株为骨架,与季节性流感病... 详细信息

目的以冷适应、减毒流感活疫苗株为载体,构建并拯救喷鼻重组HAd V疫苗候选株,并评价其免疫效果,为腺病毒候选疫苗研制提供实验数据。方法应用反向遗传学技术,以冷适应、减毒流感活疫苗A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)株为骨架,与季节性流感病毒A/California/07/209疫苗株的血凝素(haemagglutination,HA)及插入HAd V六邻体蛋白抗优势原表位的2个重复序列经改造的神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因构建流感病毒八质粒系统,转染COS-1/MDCK细胞筛选疫苗候选株并鉴定;制备的候选疫苗株滴鼻免疫Balb/c小鼠,通过中和抗体、s Ig A黏膜抗体及细胞因子的测定评价其免疫原性,并用野生HAd V-7病毒株攻击评价免疫保护效果。结果成功拯救获得重组HAd V疫苗候选株,命名为rg Flu/HAd V-Ca,其形态符合流感病毒典型特征,可有效表达HAd V病毒Hexon优势表位,且具有冷适应、减毒表型。小鼠免疫后可产生针对HAd V-7及H1N1流感病毒的特异性中和抗体,肺鼻灌洗液中可检测到针对HAd V-7中和抗体s Ig A抗体,并可检测到脾淋巴细胞分泌HAd V-7特异性细胞因子IFN-γ、IL-4;攻毒实验显示,rg Flu/HAd V-Ca疫苗候选株可有效降低小鼠肺病毒载量。结论重组冷适应、减毒HAd V活疫苗株rg Flu/HAd V-Ca具有良好的免疫效果,为腺病毒候选疫苗的研制提供了新思路。

关键词：腺病毒冷适应、减毒活疫苗六邻体抗原表位免疫效果

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副溶血弧菌calR的基因敲除株与回补株构建

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军事医学 2016年第5期40卷 374-378页

作者：侯书宁孟彦言朱文君张凌宇周冬生张义全黄新祥江苏大学医学院江苏镇江212013 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的构建副溶血弧菌calR的基因突变株和回补株,为研究CalR的功能奠定基础。方法 PCR扩增calR基因的同源臂融合片段,并直接克隆入自杀质粒p DS132中。通过接合转移的方式将重组自杀质粒转入副溶血弧菌RIMD2210633株(WT)中,利用同源重组... 详细信息

目的构建副溶血弧菌calR的基因突变株和回补株,为研究CalR的功能奠定基础。方法 PCR扩增calR基因的同源臂融合片段,并直接克隆入自杀质粒p DS132中。通过接合转移的方式将重组自杀质粒转入副溶血弧菌RIMD2210633株(WT)中,利用同源重组的方法替换原始calR基因以构建calR无痕突变株(ΔcalR)。PCR扩增calR的基因序列,并将其直接克隆入p BAD33质粒中,构建回补质粒。将回补质粒转入到ΔcalR中,即得回补株(ΔcalR/calR∷p BAD33)。将vop N的启动子区克隆入p HRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建Lac Z重组质粒,并将该重组质粒分别转入WT/p BAD33、ΔcalR/p BAD33和ΔcalR/calR∷p BAD33中,通过测定并比较3株菌中β-半乳糖苷酶活性的差异来判定CalR对vop N的调控关系。结果与结论 Lac Z结果表明,CalR负调控vop N的转录,且回补株的回补效果良好,表明成功构建了副溶血弧菌calR基因的突变株和回补株,为后续对CalR的功能研究打下了基础。

关键词：副溶血弧菌 calR 突变株回补株

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A型肉毒毒素轻链多步纯化及其金属蛋白酶活性研究

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军事医学 2016年第4期40卷 319-321页

作者：卢晓雪赵缓黄彦杰李涛王慧广西医科大学南宁530021 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的利用基因工程方法原核表达N-His标签的A型肉毒毒素轻链(Bo NT-ALC)蛋白,多步纯化获得高纯度蛋白,并对其金属蛋白酶活性进行鉴定。方法以A型肉毒毒素为模板,构建重组表达载体p ET22b-ALC,转化BL21(DE3),诱导蛋白表达,采用镍柱亲和纯... 详细信息

目的利用基因工程方法原核表达N-His标签的A型肉毒毒素轻链(Bo NT-ALC)蛋白,多步纯化获得高纯度蛋白,并对其金属蛋白酶活性进行鉴定。方法以A型肉毒毒素为模板,构建重组表达载体p ET22b-ALC,转化BL21(DE3),诱导蛋白表达,采用镍柱亲和纯化、阴离子交换以及分子筛纯化获取高纯度目的蛋白;通过体外切割特异性底物SNAP-25实验进行酶活性研究。结果与结论获得高纯度的Bo NT-ALC蛋白,对金属蛋白酶活性进行了验证。该纯化方法获得的蛋白纯度高、均一性好,且具有很好的酶活性,为后续研究奠定了基础。

关键词： A型肉毒毒素蛋白纯化金属蛋白酶类

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我国人群感染指环病毒的高通量测序分析

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中国病原生物学杂志 2016年第10期11卷 865-870页

作者：程实范航孙强裴广倩安小平米志强张湘莉兰黄勇童贻刚安徽医科大学军事医学科学院微生物流行病研究所安徽合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的分析我国人群感染指环病毒的多样性,为研究指环病毒科的感染与不同疾病发生以及宿主免疫状态之间的关系提供基础资料。方法从33份血液标本中提取病毒核酸,使用多重置换扩增技术富集指环病毒核酸,然后使用Ion Torrent PGM平台进行高... 详细信息

目的分析我国人群感染指环病毒的多样性,为研究指环病毒科的感染与不同疾病发生以及宿主免疫状态之间的关系提供基础资料。方法从33份血液标本中提取病毒核酸,使用多重置换扩增技术富集指环病毒核酸,然后使用Ion Torrent PGM平台进行高通量测序,并进行生物信息学分析。结果共得到226个新的指环病毒序列,包括130条全序和96个ORF1。受检血液标本均检出包括TTV,TTMDV和TTMV等指环病毒;测序显示指环病毒中81.9%为TTV,48.5%的标本感染两个属以上的指环病毒。指环病毒ORF1至少81.13%发生变异,其中TTV属内也存在75.66%的变异,13.27%的序列在NCBI的核酸数据库中同源比对未成功。进化分析显示TTV基因3型又可分为3.1、3.2、3.3等3个亚型,以往命名的基因2型是基因3.3型的一个子分枝。新型TTV中51.9%属于基因3型。结论我国人群普遍感染指环病毒,以基因3型感染居多且基因组多样性高。

关键词：指环病毒多重置换扩增(MDA) 输血传播病毒(TTV) 进化

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广西1例HIV-1G亚型毒株全长基因序列的测定和分析

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军事医学 2017年第2期41卷 101-105页

作者：张敏梁冰玉李天一沈平苏齐鉴李敬云李林安徽医科大学合肥230000 广西医科大学公共卫生学院广西艾滋病防治研究重点实验室南宁530021 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室全军艾滋病检测中心北京100071 钦州市钦南区疾病预防控制中心广西钦州535000 广西中医药大学附属瑞康医院南宁530021

目的对广西1例HIV-1 G亚型毒株感染者体内病毒近似全长基因组进行序列测定并进行系统进化分析。方法对前期鉴定的1例HIV-1G亚型毒株感染者进行背景信息收集,并采集其外周血,提取病毒RNA,利用逆转录巢式-PCR技术分两段扩增并测定病毒近... 详细信息

目的对广西1例HIV-1 G亚型毒株感染者体内病毒近似全长基因组进行序列测定并进行系统进化分析。方法对前期鉴定的1例HIV-1G亚型毒株感染者进行背景信息收集,并采集其外周血,提取病毒RNA,利用逆转录巢式-PCR技术分两段扩增并测定病毒近似全长基因序列。利用MEGA6软件对全长序列进行系统进化分析。结果获得了病毒近似全长基因组序列,长度为8847 bp。在系统进化树中,该毒株与G亚型参考株成簇,Bootstrap值为100%。系统溯源分析显示,该毒株与广西首次报道的G亚型JN106043毒株关系最近(Bootstrap值为100%,基因离散率为5%)。结论该毒株可能是由广西毒株传播所致,提示G亚型毒株在广西地区可能存在一定的局部流行,需进一步监测。该毒株序列的测定和分析对于广西地区HIV流行状况分析具有重要意义。

关键词： HIV-1 G亚型近似全长序列系统进化树分析

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含5种烈性出血热病毒的假病毒阳性参考品的制备

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军事医学 2016年第9期40卷 713-716,737页

作者：曹雪锋康晓平冉鑫霍耐凡吴晓燕李裕昌杨银辉安徽医科大学合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的利用慢病毒载体系统制备含有马尔堡病毒(Marburg virus)、扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire Ebola virus)、苏丹型埃博拉病毒(Sudan Ebola virus)、拉沙热病毒(Lassa fever virus)和黄热病毒(Yellow fever virus)5种烈性病毒核酸片段的假病... 详细信息

目的利用慢病毒载体系统制备含有马尔堡病毒(Marburg virus)、扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire Ebola virus)、苏丹型埃博拉病毒(Sudan Ebola virus)、拉沙热病毒(Lassa fever virus)和黄热病毒(Yellow fever virus)5种烈性病毒核酸片段的假病毒,为其核酸检测提供一种通用的阳性参考品。方法体外合成该5种病毒的目的基因片段,通过融合PCR技术将5个片段连接成一条基因,然后克隆到慢病毒表达载体上,并与其辅助载体共转染293T细胞;转染后分别于48、72 h收集培养上清,用DNase和RNase进行消化处理及纯化浓缩,最后提取核酸,利用普通PCR和实时荧光定量PCR鉴定假病毒是否包装成功。结果测序结果表明,体外合成的该5种病毒的目的基因片段已正确连接并插入慢病毒载体中;载体转染293T细胞后收集上清中的假病毒,提取核酸经上述两种PCR鉴定均可特异性检测到靶基因,表明已成功包装出含该5种出血热病毒靶基因的假病毒颗粒。结论该研究获得的假病毒颗粒可作为上述5种出血热相关烈性病毒核酸检测的通用阳性参考品。

关键词：马尔堡病毒扎伊尔型埃博拉病毒苏丹型埃博拉病毒拉沙热病毒黄热病毒假病毒阳性参考品

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肠出血性大肠杆菌z4832基因缺失突变株的构建

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安徽医科大学学报 2016年第8期51卷 1111-1115页

作者：谭林林王建新李涛王慧安徽医科大学军事医学科学院微生物流行病研究所合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的利用Red重组系统的同源重组功能,敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHEC O157∶H7)的乙酰转移酶基因z4832,构建z4832基因缺失突变株。方法EHEC O157∶H7的基因组作为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列;将上下游同源臂连接于p UC19-... 详细信息

目的利用Red重组系统的同源重组功能,敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHEC O157∶H7)的乙酰转移酶基因z4832,构建z4832基因缺失突变株。方法EHEC O157∶H7的基因组作为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列;将上下游同源臂连接于p UC19-kana质粒上卡那霉素(kana)抗性基因的两端;PCR扩增获得中间嵌合卡那霉素抗性基因的同源臂线性片段,利用质粒p KD46介导的重组技术敲除z4832基因,利用p CP20质粒介导的重组技术去除抗性标记。PCR扩增及DNA测序验证目的基因缺失后,测定突变株及野生株的生长曲线,检测在抗菌药物氧氟沙星中的存活率。结果成功构建EHEC O157∶H7 z4832基因缺失突变株。z4832缺失突变株生长速度与野生株差异无统计学意义,但在含氧氟沙星的LB培养基中突变株存活率升高(P<0.05),在含氧氟沙星的M9培养基中存活率下降(P<0.05)。结论构建z4832缺失突变株,研究z4832与肠出血性大肠杆菌耐药性之间的关系,为进一步研究乙酰转移酶在EHEC O157∶H7中的作用机制奠定了基础。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157∶H7 Red重组系统乙酰转移酶抗生素

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蜱传脑炎病毒prM-E蛋白的真核表达及其在荧光素酶免疫共沉淀技术中的应用？

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寄生虫与医学昆虫学报 2016年第1期23卷 39-44页

作者：冉鑫康晓平李裕昌吴晓燕霍耐凡贾佳曹雪峰杨银辉安徽医科大学合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

为了探索一种新型的血清学技术的荧光素酶免疫共沉淀技术（LIPS），本研究利用真核表达系统制备了蜱传脑炎病毒结构蛋白prM-E与荧光素酶融合蛋白，并评价了其在LIPS系统中的检测效果。首先以蜱传脑炎病毒RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增p... 详细信息

为了探索一种新型的血清学技术的荧光素酶免疫共沉淀技术（LIPS），本研究利用真核表达系统制备了蜱传脑炎病毒结构蛋白prM-E与荧光素酶融合蛋白，并评价了其在LIPS系统中的检测效果。首先以蜱传脑炎病毒RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增prM-E抗原基因，连接到pNLF1-secN质粒上构建真核表达载体pNLF-prM-E，使prM-E蛋白与荧光素酶串联融合表达，并将该质粒转染到Cos7细胞中。结果显示，转染重组质粒pNLF-prM-E的细胞上清中可检测到荧光素酶的高表达；进而用间接免疫荧光试验（ IFA）检测到转染的细胞与蜱传脑炎病毒抗体特异性结合；在此基础上，用LIPS方法对蜱传脑炎病毒感染患者血清进行检测，从20份患者血清中检出19份阳性，7份对照血清均为阴性。结果表明该重组抗原具有良好的特异性和灵敏性，可以用于LIPS系统中的候选检测抗原。

关键词：蜱传脑炎病毒 prM-E蛋白真核表达诊断抗原

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一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体IME-CF2的分离、测序及全基因组分析

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安徽医科大学学报 2016年第3期51卷 315-319页

作者：刘小东王伟黄勇张湘莉兰孙强安小平米志强童贻刚安徽医科大学军事医学科学院微生物流行病研究所合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的从医院污水中分离一株能裂解弗氏柠檬酸杆菌的噬菌体,观察其形态,并进行全基因组测序和全基因组分析,为治疗和控制弗氏柠檬酸杆菌感染提供基础。方法以弗氏柠檬酸杆菌为宿主,从医院污水分离噬菌体,用透射电镜观察其形态;使用Ion Tor... 详细信息

目的从医院污水中分离一株能裂解弗氏柠檬酸杆菌的噬菌体,观察其形态,并进行全基因组测序和全基因组分析,为治疗和控制弗氏柠檬酸杆菌感染提供基础。方法以弗氏柠檬酸杆菌为宿主,从医院污水分离噬菌体,用透射电镜观察其形态;使用Ion Torrent测序平台进行噬菌体全基因组测序,测序后进行噬菌体全基因组序列组装、注释、进化分析和比较分析。结果成功分离一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体,命名为IME-CF2;电镜观察显示,该噬菌体具有二十面体的头部,形态类似肌尾噬菌体科;IME-CF2核酸类型为DNA,基因组全长为177 685 bp,GC含量为43.2%;编码267个编码区(CDS),2个tRNA;进化分析表明,IME-CF2属于T4类噬菌体,全基因组比较分析表明,IME-CF2与柠檬酸杆菌噬菌体Miller同源性最高。结论分离鉴定了一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体,进行了全基因组测序和分析,为噬菌体治疗多重耐药细菌奠定了基础。

关键词：弗氏柠檬酸杆菌噬菌体全基因组测序基因组分析

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肠出血性大肠杆菌效应因子z2151的E3泛素连接酶活性鉴定

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安徽医科大学学报 2016年第8期51卷 1077-1080页

作者：陈芳红李涛李崭孙超尘王慧安徽医科大学军事医学科学院微生物流行病研究所合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的利用基因工程方法原核表达z2151蛋白,并鉴定其E3泛素连接酶活性。方法以肠出血性大肠杆菌O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因,构建重组表达载体p ET22b-z2151,转化BL21(DE3),诱导蛋白表达,采用镍柱亲和纯化获取目的蛋白;通过体外泛素... 详细信息

目的利用基因工程方法原核表达z2151蛋白,并鉴定其E3泛素连接酶活性。方法以肠出血性大肠杆菌O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因,构建重组表达载体p ET22b-z2151,转化BL21(DE3),诱导蛋白表达,采用镍柱亲和纯化获取目的蛋白;通过体外泛素化实验检测蛋白泛素连接酶活性。结果亲和纯化得到较高浓度和纯度的z2151蛋白,其在体外泛素化反应中能够促使泛素小分子形成多聚泛素链,即有E3泛素连接酶活性;而且对E2泛素结合酶具有一定的选择特异性。结论原核表达质粒p ET22b-z2151构建成功,目的蛋白z2151具有泛素连接酶的体外泛素化能力,并且针对不同的E2酶亲和力不同,这些都为后续功能机制研究奠定了基础。

关键词：基因工程肠出血性大肠杆菌O157∶H7 泛素连接酶体外泛素化

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