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安徽医科大学学报 2023年第1期58卷 15-21页

作者：罗森郭丽娜李涛王琴王慧遵义医药高等专科学校细胞生物学与免疫学教研室遵义563006 军事医学科学院微生物流行病研究所、病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的利用荧光共振能量转移(FRET)构建针对A型肉毒毒素酶活性检测的高通量体外方法。方法构建只识别A型肉毒毒素的基于双荧光标记底物的重组表达质粒,将其构建的质粒转入大肠杆菌表达系统进行表达,对表达后的荧光标记底物重组蛋白进行纯... 详细信息

目的利用荧光共振能量转移(FRET)构建针对A型肉毒毒素酶活性检测的高通量体外方法。方法构建只识别A型肉毒毒素的基于双荧光标记底物的重组表达质粒,将其构建的质粒转入大肠杆菌表达系统进行表达,对表达后的荧光标记底物重组蛋白进行纯化和透析并保存备用;利用A型肉毒毒素轻链(ALc)对重组蛋白进行酶切检测活性;对本检测方法的条件进行优化;ALc切割荧光标记底物测定其酶动力学参数K_(m)与K_(cat)值。结果重组表达质粒构建成功,通过大肠杆菌表达系统表达后检测明显出现目的条带,对其纯化后获得的重组蛋白纯度在90%左右,命名重组蛋白为CYA。对CYA通过酶ALc、B型肉毒毒素轻链(BLc)进行酶切鉴定,结果显示CYA只能被ALc酶切产生与预期相符的两个蛋白片段,不能被BLc酶切。对基于FRET底物的条件优化得到:设定滤光片灵敏度在65~110之间;实时动态检测间隔为2 min/次,动态检测时间为30~120 min,底物CYA合适的浓度范围0.5~32μmol/L。CYA在ALc酶作用下随时时间的变化与荧光值528与485的比值作图最小在0.5左右,最大时约为0.9。酶动力学参数测定ALc切割CYA的值K_(cat)值为(5±0.4)s^(-1)和K_(m)为(2.33±0.21)μmol/L。结论成功构建了基于FRET技术的A型肉毒毒素活性检测的高通量体外分析方法。

关键词： FRET 肉毒毒素高通量检测

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SARS-CoV-2亚单位疫苗制备及免疫原性初步研究

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病毒学报 2024年第5期40卷 943-951页

作者：徐骁黄涛刘铁柱芜为孙丽娜李川李建东王世文王希良传染病溯源与智能决策全国重点实验室中国疾病预防控制中心病毒性疾病预防控制所北京100052 国家卫生健康委医学病毒学与病毒病重点实验室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052 病原与生物安全国家重点实验室军事医学科学院北京微生物与流行病学研究所北京100071

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)自2019年年末出现以来,给全人类造成了严重的公共卫生事件和社会经济负担。本实验以SARS-CoV-2突变株XBB1.5的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)序列为疫苗核心分子串联SARS-CoV-2的全长S蛋白制备了亚单位纳米颗粒疫苗。将S蛋白的6个氨基酸残基突变为6个脯氨酸残基,提高表达量和蛋白质分子的稳定性。而且将弗林酶酶切位点进行突变以增加蛋白质的稳定性。在羧基端串联昆虫铁蛋白的氨基酸序列,利用铁蛋白纳米颗粒多面体可结合抗原蛋白的特性,增加抗原递呈。在氢氧化铝和CpG1018双佐剂组合免疫小鼠后,可诱导小鼠产生针对SARS-CoV-2多种变异株的中和抗体,且可诱导小鼠产生了较强的细胞免疫和体液免疫。本研究表明,XBB1.5突变株RBD区域串联S蛋白全长序列及昆虫铁蛋白制备的纳米颗粒疫苗可以有效预防SARS-CoV-2变体,是一个很好的候选疫苗分子。

关键词：新型冠状病毒亚单位疫苗受体结合域血管紧张素转化酶2

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新型脆弱拟杆菌ZY-312多糖TP2安全性评价

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现代消化及介入诊疗 2024年第10期29卷 1173-1179页

作者：邓慧敏杨斯琪毕玉晶刘洋洋王晔白杨杨瑞馥智发朝惠州市中心人民医院消化内科 516000 广州知易生物科技有限公司 510515 南方医科大学南方医院消化病学研究所消化内科广东省消化病学重点实验室 510515 军事医学科学院、微生物与流行病学研究所、病原与生物安全国家重点实验室 100071 南方医科大学南方医院增城院区消化内科 511340

目的通过细胞实验及动物实验评价一株新型脆弱拟杆菌ZY-312菌株表面多糖TP2的安全性。方法通过MTT法及实时细胞分析仪器检测不同剂量浓度的TP2对LoVo、SW480、HT-29细胞系的存活、黏附、增殖影响以检测TP2细胞毒性;给予SPF级6~8周龄BAL... 详细信息

目的通过细胞实验及动物实验评价一株新型脆弱拟杆菌ZY-312菌株表面多糖TP2的安全性。方法通过MTT法及实时细胞分析仪器检测不同剂量浓度的TP2对LoVo、SW480、HT-29细胞系的存活、黏附、增殖影响以检测TP2细胞毒性;给予SPF级6~8周龄BALB/c小鼠灌服50μg TP240次(隔日1次,共80日),监测一般情况、评估脏器病理、检测血清炎症因子及肠道菌群变化评估TP2对活体动物的影响。结果不同剂量(10~1000μg/mL)对结肠细胞系的存活、黏附、增殖无显著影响;长期服用TP2不导致小鼠腹泻、体重下降,不引起脏器病理变化,不引起血清炎症因子升高,并能显著增加小鼠肠道菌群的多样性,增加Bacteroidete、Muribaculaceae、Prevotellaceae等肠道菌群的丰度,展示了其调节肠道菌群的作用。结论脆弱拟杆菌ZY-312表面多糖TP2具有细胞及动物安全性,有望成为一种应用于临床的新型生物制剂。

关键词：脆弱拟杆菌多糖A 安全性评价肠道菌群

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河南省1272例新型冠状病毒肺炎疾病负担分析

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河南预防医学杂志 2021年第5期32卷 321-324,330页

作者：尹超男王海涛魏佳特赵琳曹务春山东大学齐鲁医学院公共卫生学院流行病学系山东济南250000 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100000

目的应用伤残调整寿命年(DALY)指标分析河南省新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎)疾病负担,同时应用DALY结合人力资本法分析河南省新冠肺炎造成的间接经济负担,为卫生部门制定防治措施及公共卫生规划提供参考依据。方法将河南省新冠肺炎确诊病... 详细信息

目的应用伤残调整寿命年(DALY)指标分析河南省新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎)疾病负担,同时应用DALY结合人力资本法分析河南省新冠肺炎造成的间接经济负担,为卫生部门制定防治措施及公共卫生规划提供参考依据。方法将河南省新冠肺炎确诊病例的发病、死亡数据根据性别、年龄进行整理,使用WHO疾病负担Excel计算模板和DisMod II计算程序进行DALY的计算,并进行不同年龄段、性别、病例临床分型等DALY的比较,再利用DALY与人力资本法结合估计河南省新冠肺炎的间接经济负担。结果截止到2020年2月27日,河南省共确诊1272例新冠肺炎病例,死亡20例,累计发病率为1.334/10万,死亡率为0.023/10万。河南省新冠肺炎疾病负担DALY总值为230.931人年,DALY强度为0.242人年/10万人,由死亡造成的疾病负担高达225.737人年,占总的DALY比例为97.75%;疾病负担随临床分型加重而不断增加,临床分型为危重型的患者疾病负担占比最高;30岁以上年龄段疾病负担占比最高,高达99.67%,其中60~69岁是DALY总值最高的年龄段,80岁以上年龄段DALY强度最高;男性新冠肺炎疾病负担高于女性;河南省1272例新冠肺炎患者总体间接经济负担为2802476.21元,人均2203.20元。结论河南省新冠肺炎疾病负担主要是由死亡造成的疾病负担,提示我们除加强预防措施外,在疾病早期应保证患者及时就医,控制病情发展。河南省人群中的60~69岁、80岁以上年龄段群体和男性是新冠肺炎防治工作的重中之重。

关键词：新型冠状病毒疾病负担 DALY 间接经济负担

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两质粒系统重配甲型H1N1流感病毒株的研究

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免疫学杂志 2018年第4期34卷 353-358页

作者：周珊珊杨晓岚孙芳程晋霞谷宏婧段跃强杨鹏辉王希良安徽医科大学研究生院合肥230601 军事医学科学院微生物流行病研究所免疫学研究室病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的构建两质粒冷适应流感病毒拯救系统,提高流感病毒的重配效率。方法本研究通过构建克隆载体pfastbac△plh HTB,将流感病毒A/Ann Arbor/6/60(H2N2)6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)的双向转录表达元件定向克隆入此载体,获得pfast... 详细信息

目的构建两质粒冷适应流感病毒拯救系统,提高流感病毒的重配效率。方法本研究通过构建克隆载体pfastbac△plh HTB,将流感病毒A/Ann Arbor/6/60(H2N2)6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)的双向转录表达元件定向克隆入此载体,获得pfastbac△plh HTBP6。同时将流感病毒A/California/7/2009(H1N1)表面基因(HA、NA)双向转录表达元件定向克隆入p ENTR-1A质粒,获得p ENTR-1AP2。将2个重组质粒共转染MDCK/COSI细胞,细胞上清接种10日龄SPF鸡胚,收取尿囊液,血凝实验筛选阳性株,并进行全面鉴定。结果本研究利用两质粒系统成功重配甲型H1N1流感病毒株,命名为TRG A/California/07/2009(H1N1)Vca,重配病毒株传代后HA效价为2~8,形态符合流感病毒典型特征,大小80~120 nm,具有冷适应、温度敏感表型。结论两质粒流感病毒拯救系统为高效重配流感疫苗株提供了新策略。

关键词：反向遗传学两质粒系统流感病毒

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铜绿假单胞菌凝集素PA-ⅠL的纯化表达及活性评价

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军事医学 2017年第3期41卷 205-208,245页

作者：徐茂凯孔德聪郑玉玲郝淮杰姜永强军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室北京100101

目的构建铜绿假单胞菌凝集素PA-ⅠL基因的重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达并评价其生物学活性。方法以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板设计引物,构建p ET-28a(+)-PA-ⅠL重组表达质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达,用Ni亲和层析... 详细信息

目的构建铜绿假单胞菌凝集素PA-ⅠL基因的重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达并评价其生物学活性。方法以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板设计引物,构建p ET-28a(+)-PA-ⅠL重组表达质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达,用Ni亲和层析法对目的蛋白进行纯化。流式细胞术评价重组表达的PA-ⅠL蛋白对细胞表面Gb3/CD77的结合活性,菌落平板计数法评价重组蛋白在细菌黏附宿主细胞过程中的功能。结果与结论 SDS-PAGE电泳显示,纯化后的PA-ⅠL蛋白具有较高的纯度,重组表达的PA-ⅠL蛋白能与细胞表面的糖鞘脂Gb3/CD77结合,且呈浓度依赖性抑制PA的PAO1对宿主细胞的黏附。

关键词：铜绿假单胞菌 PA-ⅠL蛋白糖鞘脂

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肠出血性大肠杆菌O157∶H7 z0986-z1444双缺失突变株构建

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安徽医科大学学报 2017年第2期52卷 155-159页

作者：苏莉王建新陈芳红李崭黄洁李涛王慧安徽医科大学合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物与生物安全国家重点实验室微生物组学与生物信息学研究室北京100071

目的采用Red重组方法敲除肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 z0986和z1444基因,构建双缺失突变株。方法首先构建z0986、z1444打靶片段;其次以电击法转化感受态细胞,之后通过PCR鉴定所得菌株;最终所得阳性单克隆测定生长曲线。结果 z1444... 详细信息

目的采用Red重组方法敲除肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 z0986和z1444基因,构建双缺失突变株。方法首先构建z0986、z1444打靶片段;其次以电击法转化感受态细胞,之后通过PCR鉴定所得菌株;最终所得阳性单克隆测定生长曲线。结果 z1444单基因缺失突变株(Δz1444/933)及z0986-z1444双基因缺失突变株(Δz0986/Δz1444/933)构建成功,其生长曲线与野生型EHEC O157∶H7差异均无统计学意义。结论 z0986与z1444基因缺失对EHEC的生长无影响。构建Δz1444/933及Δz0986/Δz1444/933为深入研究z1444基因的功能及作用机制奠定了基础。

关键词：肠出血性大肠杆菌 Red重组系统三型分泌系统

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流感病毒灭活疫苗可溶性微针制备及评价

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免疫学杂志 2017年第6期33卷 477-481,487页

作者：李明辉邱玉琴杨国忠刘思齐邢丽张良艳周娅杨鹏辉高云华王希良宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫学教研室银川750004 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 中国科学院理化技术研究所北京100190

目的初步研究负载流感全病毒灭活疫苗可溶性微针体外评价方法和经皮免疫效果。方法将流感全病毒灭活疫苗溶液与微针基质材料混匀干燥后复溶,体外血凝试验检测疫苗血凝素活性,透射电镜和动态光散射分析疫苗微针复溶后流感全病毒疫苗变化... 详细信息

目的初步研究负载流感全病毒灭活疫苗可溶性微针体外评价方法和经皮免疫效果。方法将流感全病毒灭活疫苗溶液与微针基质材料混匀干燥后复溶,体外血凝试验检测疫苗血凝素活性,透射电镜和动态光散射分析疫苗微针复溶后流感全病毒疫苗变化情况;选择筛选的材料羧甲基纤维素和硫酸软骨素作为主要基质与疫苗混匀制备微针溶液,滴加到微针制作模具上,抽真空使疫苗基质溶液填充针体,室温干燥、脱模,贴于猪皮肤检测微针硬度,将Cy7标记流感疫苗可溶性微针贴于小鼠腹部后活体成像检测流感疫苗皮内存留时间,动物免疫试验第2次免疫后14 d检测血抑效价。结果通过血凝试验筛选出硫酸软骨素和羧甲基纤维素为主要基质,贴片疫苗血凝活性为96%和86%,显著高于其它3种材料贴片疫苗活性;透射电镜显示PBS对照组中流感灭活病毒颗粒多呈单个散在分布,罕见聚团,2种贴片复溶后流感灭活病毒多呈聚团,罕见单个病毒颗粒;动态光散射分析显示疫苗贴片复溶后病毒颗粒粒径明显增大,高于对照组中病毒粒径;皮肤组织病理显示2种疫苗微针均可刺穿猪皮肤;活体成像显示疫苗微针刺穿小鼠皮肤并溶解于皮内,疫苗存留时间较肌肉长;Balb/c小鼠免疫后分离血清,血凝抑制试验显示2种微针均产生血抑效价且硫酸软骨素微针血抑效价高于羧甲基纤维素微针。结论可溶性疫苗微针可刺穿皮肤溶于皮内产生免疫应答,为微针疫苗的研究提供了思路。

关键词：微针可溶性流感疫苗

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3种方法对鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的鉴定

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第三军医大学学报 2016年第11期38卷 1205-1209页

作者：康琳高姗周阳辛文文杨浩方瑶毛旭虎王景林军事医学科学院微生物流行病学研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 第三军医大学西南医院医学检验系临床微生物及免疫学教研室重庆400038

目的用3种检测方法对同源性较高的鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌进行鉴定,比较该3种检测方法的鉴定效果。方法分别利用基于MALDI-TOF-MS的蛋白指纹图谱方法、双重荧光定量PCR方法和16S rRNA基因序列分析方法对5株鼻疽伯克霍尔... 详细信息

目的用3种检测方法对同源性较高的鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌进行鉴定,比较该3种检测方法的鉴定效果。方法分别利用基于MALDI-TOF-MS的蛋白指纹图谱方法、双重荧光定量PCR方法和16S rRNA基因序列分析方法对5株鼻疽伯克霍尔德菌和5株类鼻疽伯克霍尔德菌进行鉴定,综合判断鉴定结果,并与传统的形态学和生化鉴定结果比较,寻找更适合于该两种菌的鉴定方法。结果在10株受试菌株中,2株排除是鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的可能,剩余8株之中,MALDI-TOF-MS方法正确鉴定了6株,双重荧光定量PCR方法正确鉴定了8株,16S rRNA基因序列分析方法正确鉴定4株。结论 MALDI-TOF-MS的蛋白指纹图谱方法和双重荧光定量PCR方法对鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌具有很好的鉴定能力,16S rRNA基因序列分析方法不适合用于该2种菌的鉴定。

关键词：鼻疽伯克霍尔德菌类鼻疽伯克霍尔德菌 MALDI-TOF-MS FQ-PCR 16S rRNA基因序列分析

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2.3.2.1c家系H5N1禽流感病毒在我国的持续传播与进化

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中国病原生物学杂志 2016年第2期11卷 97-102,115页

作者：王海明陈占强张振杰吕强韦庆娟童贻刚安小平孙淑红史卫峰山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 泰山医学院病原生物学研究所山东泰安271000 东营市林木植物保护站山东东营257091 泰山医学院公共卫生学院山东泰安271016 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的研究我国流行的H5N1高致病性禽流感病毒的进化与传播。方法从山东一养鸭场采集鸭粪标本,进行甲型流感PCR检测和分型,对阳性标本进行全基因组序列测定。对获取的全基因组序列进行系统发育分析,并研究其基因组的分子特征。结果 PCR检... 详细信息

目的研究我国流行的H5N1高致病性禽流感病毒的进化与传播。方法从山东一养鸭场采集鸭粪标本,进行甲型流感PCR检测和分型,对阳性标本进行全基因组序列测定。对获取的全基因组序列进行系统发育分析,并研究其基因组的分子特征。结果 PCR检测有4份标本甲型流感病毒阳性,均为H5亚型,命名为A/Duck/Shandong/1-14/2014(H5N1)。病毒HA基因系统发育分析表明该病毒属于2.3.2.1c家系。测序分析表明,该病毒除了PB2基因来自H9N2亚型外,其余7个基因均来自H5N1。该毒株与北美首例人感染H5N1和造成2015年1月河南三门峡野鸟疫情的毒株属于同一个基因型。尚未发现该基因型毒株在关键氨基酸位点发生变异。结论 2014年山东分离株HA属于2.3.2.1c家系,为一新近报道的基因型。该基因型病毒于不同时间在我国的北京、山东和河南等地家禽和野鸟中出现,表明其已具备了一定的适应性并在持续传播。因此,应对该病毒的传播进行持续监测。

关键词： H5N1 高致病性禽流感 2.3.2.1c家系病毒进化

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