检索结果-内蒙古大学图书馆

安徽医科大学学报 2023年第1期58卷 15-21页

作者：罗森郭丽娜李涛王琴王慧遵义医药高等专科学校细胞生物学与免疫学教研室遵义563006 军事医学科学院微生物流行病研究所、病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的利用荧光共振能量转移(FRET)构建针对A型肉毒毒素酶活性检测的高通量体外方法。方法构建只识别A型肉毒毒素的基于双荧光标记底物的重组表达质粒,将其构建的质粒转入大肠杆菌表达系统进行表达,对表达后的荧光标记底物重组蛋白进行纯... 详细信息

目的利用荧光共振能量转移(FRET)构建针对A型肉毒毒素酶活性检测的高通量体外方法。方法构建只识别A型肉毒毒素的基于双荧光标记底物的重组表达质粒,将其构建的质粒转入大肠杆菌表达系统进行表达,对表达后的荧光标记底物重组蛋白进行纯化和透析并保存备用;利用A型肉毒毒素轻链(ALc)对重组蛋白进行酶切检测活性;对本检测方法的条件进行优化;ALc切割荧光标记底物测定其酶动力学参数K_(m)与K_(cat)值。结果重组表达质粒构建成功,通过大肠杆菌表达系统表达后检测明显出现目的条带,对其纯化后获得的重组蛋白纯度在90%左右,命名重组蛋白为CYA。对CYA通过酶ALc、B型肉毒毒素轻链(BLc)进行酶切鉴定,结果显示CYA只能被ALc酶切产生与预期相符的两个蛋白片段,不能被BLc酶切。对基于FRET底物的条件优化得到:设定滤光片灵敏度在65~110之间;实时动态检测间隔为2 min/次,动态检测时间为30~120 min,底物CYA合适的浓度范围0.5~32μmol/L。CYA在ALc酶作用下随时时间的变化与荧光值528与485的比值作图最小在0.5左右,最大时约为0.9。酶动力学参数测定ALc切割CYA的值K_(cat)值为(5±0.4)s^(-1)和K_(m)为(2.33±0.21)μmol/L。结论成功构建了基于FRET技术的A型肉毒毒素活性检测的高通量体外分析方法。

关键词： FRET 肉毒毒素高通量检测

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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染小鼠致肺炎的模型构建与特征分析

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中国人兽共患病学报 2023年第5期39卷 447-454页

作者：赵玥周冬生杨文慧秦佟童吕蒙翟丽娜张丽丽商正玲贵州医科大学基础医学院免疫学教研室贵阳550025 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物与生物安全国家重点实验室北京100071 军事科学院军事医学研究院实验动物中心北京100071

目的建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的BALB/c小鼠吸入感染肺炎恢复模型,并评价模型的病原学、病理学、免疫学特征。方法将MRSA以气溶胶肺递送途径感染小鼠,在7 d内观察小鼠状态与死... 详细信息

目的建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的BALB/c小鼠吸入感染肺炎恢复模型,并评价模型的病原学、病理学、免疫学特征。方法将MRSA以气溶胶肺递送途径感染小鼠,在7 d内观察小鼠状态与死亡情况。选择亚致死剂量构建小鼠肺炎恢复模型,检测感染后小鼠的血液及心、肝、脾、肺、肾组织中的细菌载量及病理变化,并对血清与肺泡灌洗液中的细胞因子及肺组织的重要细胞群的变化趋势进行检测。结果致死剂量感染后小鼠的死亡时间集中在48 h内。亚致死剂量感染小鼠后,肺部的病变以48~72 h最为严重,其余组织器官无严重病变;多种细胞因子在12~48 h浓度升高至峰值,在96 h下降至接近感染前水平;在感染后48 h内的肺中,中性粒细胞、树突状细胞、炎性单核细胞、间质巨噬细胞和内皮细胞的比例明显增加,而T细胞、B细胞、肺泡巨噬细胞和上皮细胞的比例则下降。大部分细胞群的比例在96 h恢复至接近感染前水平。结论本研究成功构建了小鼠吸入MRSA感染肺炎恢复模型,并通过多种指标的检测明确0~96 h是小鼠感染后的应答关键期。该小鼠模型可用于深入开展MRSA感染的发病机理、免疫调控、治疗评价等研究,具有良好的应用价值。

关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌小鼠模型肺部感染气溶胶

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两质粒系统重配甲型H1N1流感病毒株的研究

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免疫学杂志 2018年第4期34卷 353-358页

作者：周珊珊杨晓岚孙芳程晋霞谷宏婧段跃强杨鹏辉王希良安徽医科大学研究生院合肥230601 军事医学科学院微生物流行病研究所免疫学研究室病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的构建两质粒冷适应流感病毒拯救系统,提高流感病毒的重配效率。方法本研究通过构建克隆载体pfastbac△plh HTB,将流感病毒A/Ann Arbor/6/60(H2N2)6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)的双向转录表达元件定向克隆入此载体,获得pfast... 详细信息

目的构建两质粒冷适应流感病毒拯救系统,提高流感病毒的重配效率。方法本研究通过构建克隆载体pfastbac△plh HTB,将流感病毒A/Ann Arbor/6/60(H2N2)6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)的双向转录表达元件定向克隆入此载体,获得pfastbac△plh HTBP6。同时将流感病毒A/California/7/2009(H1N1)表面基因(HA、NA)双向转录表达元件定向克隆入p ENTR-1A质粒,获得p ENTR-1AP2。将2个重组质粒共转染MDCK/COSI细胞,细胞上清接种10日龄SPF鸡胚,收取尿囊液,血凝实验筛选阳性株,并进行全面鉴定。结果本研究利用两质粒系统成功重配甲型H1N1流感病毒株,命名为TRG A/California/07/2009(H1N1)Vca,重配病毒株传代后HA效价为2~8,形态符合流感病毒典型特征,大小80~120 nm,具有冷适应、温度敏感表型。结论两质粒流感病毒拯救系统为高效重配流感疫苗株提供了新策略。

关键词：反向遗传学两质粒系统流感病毒

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医院感染细菌性肺炎患者多重耐药菌感染及30 d内死亡危险因素分析

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检验医学 2019年第4期34卷 300-304页

作者：李静刘雪超孙惠敏崔冰漪刘秀玮唐山市中医医院免疫发光科河北唐山063000 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 唐山市中医医院肺系病科河北唐山063000

目的探讨医院感染细菌性肺炎的病原谱和耐药情况,分析患者感染30 d内死亡的危险因素。方法回顾性分析2017年1—12月唐山市中医医院医院感染细菌性肺炎患者的临床资料,分析病原菌分布及耐药情况。采用Logistic回归分析和Cox回归分析评估... 详细信息

目的探讨医院感染细菌性肺炎的病原谱和耐药情况,分析患者感染30 d内死亡的危险因素。方法回顾性分析2017年1—12月唐山市中医医院医院感染细菌性肺炎患者的临床资料,分析病原菌分布及耐药情况。采用Logistic回归分析和Cox回归分析评估相关危险因素。结果患者年龄、重症监护病房(ICU)入住>7 d、接受有创机械性通气>7 d是患者发生多重耐药(MDR)菌感染的独立危险因素;患者年龄、肺部肿瘤及合并机体其他部位感染是细菌性肺炎患者30 d内死亡的独立危险因素。结论明确了医院感染细菌性肺炎患者发生MDR及30 d内死亡的危险因素,为临床制定相应预防、治疗措施提供了理论依据。

关键词：医院感染细菌性肺炎危险因素多重耐药菌死亡

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基于FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法

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安徽医科大学学报 2018年第5期53卷 739-745页

作者：罗森丁朋晓李涛王琴王慧遵义医药高等专科学校病原生物与免疫教研室遵义563006 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的利用FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法。方法构建针对破伤风毒素和B型肉毒毒素的双荧光标记底物的重组表达质粒,表达并纯化荧光标记底物重组蛋白;利用A型肉毒毒素轻链(ALc),B型肉毒毒素轻链(BLc)... 详细信息

目的利用FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法。方法构建针对破伤风毒素和B型肉毒毒素的双荧光标记底物的重组表达质粒,表达并纯化荧光标记底物重组蛋白;利用A型肉毒毒素轻链(ALc),B型肉毒毒素轻链(BLc)和破伤风毒素轻链(TLc)分别对目的蛋白进行酶切反应。对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件进行优化。酶动力学参数分别测定TLc和BLc切割底物荧光标记底物的Km和Kcat值。结果设计并成功构建荧光标记底物的重组表达质粒。表达并纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白,命名为CYVAMP。利用ALc、BLc和TLc分别对CYVAMP进行酶切,CYVAMP能被BLc和TLc识别切割而不能被ALc切割。对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件优化得到:CYVAMP较适宜的范围为0.2~32μmol/L,酶标仪滤光片灵敏度设定的较合适的设置范围在65~110;(对于96孔板)动态实时检测间隔时间2 min较为合适,检测持续时间从30 min到120 min较合适。CYVAMP在内肽酶BLc作用下随反应时间变化与荧光值528与485比值作图最大时在1.5左右,最小在0.5左右。酶动力学参数测定得到BLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(17.6±2.6)μmol/L和(4.16±0.28)s-1。TLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(40.8±3.5)μmol/L和(2.65±0.32)s-1。结论成功构建基于FRET技术的分析法能满足对破伤风毒素和B型肉毒毒素的检测及抑制剂的高通量体外筛选所需。

关键词： FRET 肉毒毒素破伤风毒素高通量筛选

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铜绿假单胞菌凝集素PA-ⅠL的纯化表达及活性评价

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军事医学 2017年第3期41卷 205-208,245页

作者：徐茂凯孔德聪郑玉玲郝淮杰姜永强军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室北京100101

目的构建铜绿假单胞菌凝集素PA-ⅠL基因的重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达并评价其生物学活性。方法以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板设计引物,构建p ET-28a(+)-PA-ⅠL重组表达质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达,用Ni亲和层析... 详细信息

目的构建铜绿假单胞菌凝集素PA-ⅠL基因的重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达并评价其生物学活性。方法以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板设计引物,构建p ET-28a(+)-PA-ⅠL重组表达质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达,用Ni亲和层析法对目的蛋白进行纯化。流式细胞术评价重组表达的PA-ⅠL蛋白对细胞表面Gb3/CD77的结合活性,菌落平板计数法评价重组蛋白在细菌黏附宿主细胞过程中的功能。结果与结论 SDS-PAGE电泳显示,纯化后的PA-ⅠL蛋白具有较高的纯度,重组表达的PA-ⅠL蛋白能与细胞表面的糖鞘脂Gb3/CD77结合,且呈浓度依赖性抑制PA的PAO1对宿主细胞的黏附。

关键词：铜绿假单胞菌 PA-ⅠL蛋白糖鞘脂

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流感病毒灭活疫苗可溶性微针制备及评价

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免疫学杂志 2017年第6期33卷 477-481,487页

作者：李明辉邱玉琴杨国忠刘思齐邢丽张良艳周娅杨鹏辉高云华王希良宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫学教研室银川750004 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 中国科学院理化技术研究所北京100190

目的初步研究负载流感全病毒灭活疫苗可溶性微针体外评价方法和经皮免疫效果。方法将流感全病毒灭活疫苗溶液与微针基质材料混匀干燥后复溶,体外血凝试验检测疫苗血凝素活性,透射电镜和动态光散射分析疫苗微针复溶后流感全病毒疫苗变化... 详细信息

目的初步研究负载流感全病毒灭活疫苗可溶性微针体外评价方法和经皮免疫效果。方法将流感全病毒灭活疫苗溶液与微针基质材料混匀干燥后复溶,体外血凝试验检测疫苗血凝素活性,透射电镜和动态光散射分析疫苗微针复溶后流感全病毒疫苗变化情况;选择筛选的材料羧甲基纤维素和硫酸软骨素作为主要基质与疫苗混匀制备微针溶液,滴加到微针制作模具上,抽真空使疫苗基质溶液填充针体,室温干燥、脱模,贴于猪皮肤检测微针硬度,将Cy7标记流感疫苗可溶性微针贴于小鼠腹部后活体成像检测流感疫苗皮内存留时间,动物免疫试验第2次免疫后14 d检测血抑效价。结果通过血凝试验筛选出硫酸软骨素和羧甲基纤维素为主要基质,贴片疫苗血凝活性为96%和86%,显著高于其它3种材料贴片疫苗活性;透射电镜显示PBS对照组中流感灭活病毒颗粒多呈单个散在分布,罕见聚团,2种贴片复溶后流感灭活病毒多呈聚团,罕见单个病毒颗粒;动态光散射分析显示疫苗贴片复溶后病毒颗粒粒径明显增大,高于对照组中病毒粒径;皮肤组织病理显示2种疫苗微针均可刺穿猪皮肤;活体成像显示疫苗微针刺穿小鼠皮肤并溶解于皮内,疫苗存留时间较肌肉长;Balb/c小鼠免疫后分离血清,血凝抑制试验显示2种微针均产生血抑效价且硫酸软骨素微针血抑效价高于羧甲基纤维素微针。结论可溶性疫苗微针可刺穿皮肤溶于皮内产生免疫应答,为微针疫苗的研究提供了思路。

关键词：微针可溶性流感疫苗

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肠出血性大肠杆菌O157∶H7 z0986-z1444双缺失突变株构建

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安徽医科大学学报 2017年第2期52卷 155-159页

作者：苏莉王建新陈芳红李崭黄洁李涛王慧安徽医科大学合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物与生物安全国家重点实验室微生物组学与生物信息学研究室北京100071

目的采用Red重组方法敲除肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 z0986和z1444基因,构建双缺失突变株。方法首先构建z0986、z1444打靶片段;其次以电击法转化感受态细胞,之后通过PCR鉴定所得菌株;最终所得阳性单克隆测定生长曲线。结果 z1444... 详细信息

目的采用Red重组方法敲除肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 z0986和z1444基因,构建双缺失突变株。方法首先构建z0986、z1444打靶片段;其次以电击法转化感受态细胞,之后通过PCR鉴定所得菌株;最终所得阳性单克隆测定生长曲线。结果 z1444单基因缺失突变株(Δz1444/933)及z0986-z1444双基因缺失突变株(Δz0986/Δz1444/933)构建成功,其生长曲线与野生型EHEC O157∶H7差异均无统计学意义。结论 z0986与z1444基因缺失对EHEC的生长无影响。构建Δz1444/933及Δz0986/Δz1444/933为深入研究z1444基因的功能及作用机制奠定了基础。

关键词：肠出血性大肠杆菌 Red重组系统三型分泌系统

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3种方法对鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的鉴定

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第三军医大学学报 2016年第11期38卷 1205-1209页

作者：康琳高姗周阳辛文文杨浩方瑶毛旭虎王景林军事医学科学院微生物流行病学研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 第三军医大学西南医院医学检验系临床微生物及免疫学教研室重庆400038

目的用3种检测方法对同源性较高的鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌进行鉴定,比较该3种检测方法的鉴定效果。方法分别利用基于MALDI-TOF-MS的蛋白指纹图谱方法、双重荧光定量PCR方法和16S rRNA基因序列分析方法对5株鼻疽伯克霍尔... 详细信息

目的用3种检测方法对同源性较高的鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌进行鉴定,比较该3种检测方法的鉴定效果。方法分别利用基于MALDI-TOF-MS的蛋白指纹图谱方法、双重荧光定量PCR方法和16S rRNA基因序列分析方法对5株鼻疽伯克霍尔德菌和5株类鼻疽伯克霍尔德菌进行鉴定,综合判断鉴定结果,并与传统的形态学和生化鉴定结果比较,寻找更适合于该两种菌的鉴定方法。结果在10株受试菌株中,2株排除是鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的可能,剩余8株之中,MALDI-TOF-MS方法正确鉴定了6株,双重荧光定量PCR方法正确鉴定了8株,16S rRNA基因序列分析方法正确鉴定4株。结论 MALDI-TOF-MS的蛋白指纹图谱方法和双重荧光定量PCR方法对鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌具有很好的鉴定能力,16S rRNA基因序列分析方法不适合用于该2种菌的鉴定。

关键词：鼻疽伯克霍尔德菌类鼻疽伯克霍尔德菌 MALDI-TOF-MS FQ-PCR 16S rRNA基因序列分析

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2.3.2.1c家系H5N1禽流感病毒在我国的持续传播与进化

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中国病原生物学杂志 2016年第2期11卷 97-102,115页

作者：王海明陈占强张振杰吕强韦庆娟童贻刚安小平孙淑红史卫峰山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 泰山医学院病原生物学研究所山东泰安271000 东营市林木植物保护站山东东营257091 泰山医学院公共卫生学院山东泰安271016 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的研究我国流行的H5N1高致病性禽流感病毒的进化与传播。方法从山东一养鸭场采集鸭粪标本,进行甲型流感PCR检测和分型,对阳性标本进行全基因组序列测定。对获取的全基因组序列进行系统发育分析,并研究其基因组的分子特征。结果 PCR检... 详细信息

目的研究我国流行的H5N1高致病性禽流感病毒的进化与传播。方法从山东一养鸭场采集鸭粪标本,进行甲型流感PCR检测和分型,对阳性标本进行全基因组序列测定。对获取的全基因组序列进行系统发育分析,并研究其基因组的分子特征。结果 PCR检测有4份标本甲型流感病毒阳性,均为H5亚型,命名为A/Duck/Shandong/1-14/2014(H5N1)。病毒HA基因系统发育分析表明该病毒属于2.3.2.1c家系。测序分析表明,该病毒除了PB2基因来自H9N2亚型外,其余7个基因均来自H5N1。该毒株与北美首例人感染H5N1和造成2015年1月河南三门峡野鸟疫情的毒株属于同一个基因型。尚未发现该基因型毒株在关键氨基酸位点发生变异。结论 2014年山东分离株HA属于2.3.2.1c家系,为一新近报道的基因型。该基因型病毒于不同时间在我国的北京、山东和河南等地家禽和野鸟中出现,表明其已具备了一定的适应性并在持续传播。因此,应对该病毒的传播进行持续监测。

关键词： H5N1 高致病性禽流感 2.3.2.1c家系病毒进化

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