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2015年中国微生物学会学术年会

作者：韩剑峰军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室

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分枝杆菌噬菌体D29气溶胶吸入治疗肺结核的实验研究

分枝杆菌噬菌体D29气溶胶吸入治疗肺结核的实验研究

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第二届全国生物颗粒学术研讨会、第三届国际工业药学和临床药学研讨会暨第一届岭南国际药学大会

作者：刘克洋温占波杨文慧胡凌飞李娜王洁李劲松军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室

耐药结核分枝杆菌已经给人类的健康带来了极大的威胁,由于结核菌对现有药物的耐药性,急需新的治疗方法.分枝杆菌噬菌体D29是一种烈性噬菌体,既能裂解快生长的分枝杆菌,又能裂解慢生长的分枝杆菌.目前,国外尚未见噬菌体D29吸入治疗肺结...

耐药结核分枝杆菌已经给人类的健康带来了极大的威胁,由于结核菌对现有药物的耐药性,急需新的治疗方法.分枝杆菌噬菌体D29是一种烈性噬菌体,既能裂解快生长的分枝杆菌,又能裂解慢生长的分枝杆菌.目前,国外尚未见噬菌体D29吸入治疗肺结核治疗的研究报道.我们利用Collison 6孔发生器、STAG单分散气溶胶发生器作为本项研究的噬菌体D29气溶胶发生器.Collison 6孔发生器和STAG单分散气溶胶发生器安装在动物口鼻暴露装置上,喷雾液浓度都为109PFU/mL,二种发生器产生的噬菌体D29气溶胶数量中值直径分别为0.8μm和1.5μm,几何标准偏离1.7.用Collison 6孔发生器、STAG单分散气溶胶发生器产生不同粒径的噬菌体D29气溶胶, 30只小鼠放置在动物口鼻暴露装置中,喷雾液浓度为109 PFU/mL.小鼠吸入噬菌体D29气溶胶后,取口鼻部位、气管和各肺叶,除口鼻部位用缓冲液浸泡外,其余组织利用组织匀浆器磨碎后离心,平板培养检测噬菌体含量,根据结果计算各部位沉积率.按照DeLormeand Moss 2002年提出的呼吸量,0.8μm噬菌体气溶胶粒子在小鼠口鼻、肺部和呼吸道的沉积率分别为0.09％、0.11％和0.22％,1.5μm气溶胶粒子在小鼠口鼻、肺部和呼吸道的沉积率分别为0.85％、1.67％和2.80％,2μm噬菌体D29气溶胶粒子在小鼠肺部和呼吸道的沉积率分别为18.20％和21.91％.以上研究结果表明,应用噬菌体D29气溶胶吸入给药方式治疗肺结核是一种有效的新技术方法.

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鼠疫菌毒力相关蛋白Pla和pH6在感染恒河猴组织中的检测及意义

鼠疫菌毒力相关蛋白Pla和pH6在感染恒河猴组织中的检测及意义

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2015年全国电子显微学学术会议

作者：田光吴小红李豫川严格徐在海姜永强王效义病原微生物生物安全国家重点实验室军事医学科学院微生物流行病研究所北京 100071

纤溶酶原激活蛋白(plasminogen activator,Pla)是一种丝氨酸蛋白酶,是鼠疫经皮下途径感染所必须的毒力侵袭因子.pH6抗原是在哺乳动物体内局部酸化的环境中(pH=6.0)由细菌染色体DNA编码的的一种表面蛋白(菌毛结构),是鼠疫菌毒力的重要组...

纤溶酶原激活蛋白(plasminogen activator,Pla)是一种丝氨酸蛋白酶,是鼠疫经皮下途径感染所必须的毒力侵袭因子.pH6抗原是在哺乳动物体内局部酸化的环境中(pH=6.0)由细菌染色体DNA编码的的一种表面蛋白(菌毛结构),是鼠疫菌毒力的重要组成部分.本实验在前期工作的基础上,开展了在恒河猴组织中检测鼠疫菌毒力相关蛋白Pla和pH6的研究工作,探讨其对恒河猴的致病机理.

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基于上转发光免疫层析技术的常见食源性致病菌快速检测方法研究与评价

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军事医学 2015年第2期39卷 128-132页

作者：李春凤赵勇王晓英张平平刘晓孙崇云杨瑞馥王成彬周蕾解放军总医院临床检验科北京100853 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 海军总医院内分泌科北京100048 重庆医科大学公共卫生与管理学院重庆400016

目的研制针对4种常见食源性致病菌：甲型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi A）、乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）、大肠埃希菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的基于上... 详细信息

目的研制针对4种常见食源性致病菌：甲型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi A）、乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）、大肠埃希菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的基于上转发光免疫层析技术（UPT-LF）的快速定量检测试纸,并对其检测性能进行评价。方法以上转发光纳米颗粒（UCP-NPs）作为示踪物,基于双抗体夹心检测模型,研制针对上述4种靶标菌的UPT-LF试纸;以4种靶标菌的系列浓度标准菌悬液作为标准样品,评价试纸的敏感性、特异性、线性和精密性,并进行模拟染菌食品的检测,评价模拟样品阳性检出率。结果针对4种靶标菌的UPT-LF试纸均具有良好的线性,相关系数r为0.985-0.996;检测敏感性达10^5-10^6CFU/ml,与其他近缘菌株无交叉反应;对乳制品、饮料、小食品、水产、肉类等细菌污染的食品检出率较高。结论该研究建立的对4种常见食源性致病菌进行快速检测的UPT-LF,简便快速,具有良好的敏感性、特异性和线性定量能力,操作性能可满足食品安全检测的要求。

关键词：上转发光纳米颗粒侧流术定量检测食源性致病菌甲型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌大肠埃希菌O157∶H7 副溶血弧菌

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基于蚊虫RNA干扰显微注射方法的建立

基于蚊虫RNA干扰显微注射方法的建立

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中国动物学会寄生虫学专业委员会第十五次全国学术会议暨第六次国际寄生虫学学术研讨会

作者：吴群李春晓韩谦赵彤言海南大学军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室

目的:随着生物技术的快速发展,很多新的技术被应用到蚊虫嗅觉蛋白基因的功能研究中,其中RNA干扰技术(RNAi)的应用,加快了基因功能的研究,将RNAi应用于蚊虫气味受体基因的研究,最关键的是怎样将ds RNA导入蚊虫体内,目前应用最多方法为显... 详细信息

目的:随着生物技术的快速发展,很多新的技术被应用到蚊虫嗅觉蛋白基因的功能研究中,其中RNA干扰技术(RNAi)的应用,加快了基因功能的研究,将RNAi应用于蚊虫气味受体基因的研究,最关键的是怎样将ds RNA导入蚊虫体内,目前应用最多方法为显微注射,显微注射成功与否对蚊虫RNA干扰实验至关重要。本研究以致倦库蚊成蚊为注射对象来研究最佳显微注射方法。方法:选取羽化后的蚊虫进行冰冻,通过冰冻时间长短来确定最佳麻醉蚊虫时间,然后对其进行注射,通过注射蚊虫胸部不同位置来确定最佳注射位置,注射时通过注射不同体积来确定最佳注射体积,最后通过综合计算蚊虫的成活率来获得最佳注射方案。结果:蚊虫冰冻4min能达到最佳麻醉效果。时间低于4min蚊虫能快速恢复,高于4min中达到5min时虽然蚊虫恢复时间要比4min更长有利于注射,但能对蚊虫造成伤害,死亡率达到了17.13%,正对胸部注射蚊虫的成活率(65%)低于从侧面注射的成活率(93.5%),当注射量达到1μL时可以明显观察到雌蚊腹部明显变化并不影响其成活率。结论:通过实验得出的最佳蚊虫微量注射方法为:选取羽化3-5天蚊虫冰冻4min放置与冰盒上从蚊虫胸部侧面注入1μL液体于蚊虫体内。

关键词： RNAi 蚊虫微量注射

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质粒介导碳青霉烯耐药机制研究

质粒介导碳青霉烯耐药机制研究

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2015年中国微生物学会学术年会

作者：周冬生邱业峰殷喆冯娇军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室军事医学科学院实验动物中心

碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广、抗菌活性最强的非典型β-内酰胺类抗菌药物,因具有对β-内酰胺酶稳定、毒性低、见效快、预后好等特点,已经成为治疗危重感染或初始抗生素治疗失败的复杂感染的最常用抗菌药物之一.但是,由于近年来碳青霉...

碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广、抗菌活性最强的非典型β-内酰胺类抗菌药物,因具有对β-内酰胺酶稳定、毒性低、见效快、预后好等特点,已经成为治疗危重感染或初始抗生素治疗失败的复杂感染的最常用抗菌药物之一.但是,由于近年来碳青霉烯类抗生素在临床上的广泛应用及不合理使用,临床上已有不动杆菌、假单胞菌、肠杆菌科细菌等为主的碳青霉烯耐药菌出现和蔓延,使得临床抗感染治疗面临着前所未有的严峻挑战.

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肠出血性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统ATP水解酶escN基因突变株的构建

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生物技术通讯 2015年第3期26卷 346-348页

作者：陈芳红李涛王慧安徽医科大学安徽合肥2300322 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的:利用λ噬菌体的Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的Ⅲ型分泌系统ATP水解酶Esc N,构建大肠杆菌esc N基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别酶切连接于p UC19-kan质粒上,PCR获得中间... 详细信息

目的:利用λ噬菌体的Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的Ⅲ型分泌系统ATP水解酶Esc N,构建大肠杆菌esc N基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别酶切连接于p UC19-kan质粒上,PCR获得中间嵌合卡那霉素抗性基因(带有FRT位点)的同源线性片段,利用质粒p KD46和p CP20介导的重组技术敲除esc N基因,并去除抗性标记;PCR及测序验证目的基因缺失后,测定缺失株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的esc N基因,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:构建了Ⅲ型分泌系统缺陷菌株,为进一步研究Ⅲ型分泌系统因子在肠出血性大肠杆菌致病过程中的作用奠定了基础。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157∶H7 Ⅲ型分泌系统 Red重组系统

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致倦库蚊卵黄羧前体基因的克隆及定量分析

致倦库蚊卵黄羧前体基因的克隆及定量分析

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中国动物学会寄生虫学专业委员会第十五次全国学术会议暨第六次国际寄生虫学学术研讨会

作者：刘钦梅李春晓赵彤言韩谦刁晓平海南大学农学院军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室

目的:本文克隆致倦库蚊卵黄酸前体基因,并分析其是否与抗药性相关。方法:通过幼虫生物测定方法,得到致倦库蚊实验室敏感株、三亚野外抗性株和三亚药物筛选株各自LC50。同时设计特异性引物,PCR扩增得到致倦库蚊卵黄酸前体基因片段,采用S... 详细信息

目的:本文克隆致倦库蚊卵黄酸前体基因,并分析其是否与抗药性相关。方法:通过幼虫生物测定方法,得到致倦库蚊实验室敏感株、三亚野外抗性株和三亚药物筛选株各自LC50。同时设计特异性引物,PCR扩增得到致倦库蚊卵黄酸前体基因片段,采用SYBR荧光定量方法,以致倦库蚊核糖体蛋白L8基因作为内参,比较了卵黄酸前体基因在实验室敏感株、三亚野外抗性株和三亚药物筛选株表达量的差异。结果:致倦库蚊实验室敏感株、三亚野外抗性株和三亚药物筛选株的LC50从低到高;而卵黄酸前体基因在实验室敏感株表达量最高,三亚药物筛选株表达量最低,在三亚野外抗性株的表达量介于实验室敏感株和三亚药物筛选株之间。致倦库蚊的抗药性越高,卵黄酸前体基因的表达量越低;两者之间存在着负相关关系。结论:抗药性不同的致倦库蚊卵黄酸前体基因的表达量不同,推测卵黄酸前体基因为致倦库蚊抗性相关的新基因,为研究致倦库蚊的抗药性提供了新的方向。

关键词：致倦库蚊抗药性卵黄羧前体基因实时定量PCR

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A型肉毒毒素轻链的原核表达、纯化及活性鉴定

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生物技术通讯 2015年第5期26卷 632-635页

作者：罗森齐芬芳宫路路刘昊李涛王慧遵义医药高等专科学校贵州遵义563002 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的:在大肠杆菌中表达、纯化A型肉毒毒素轻链(Bo NT/A LC),研究其生物学活性。方法:根据Gen Bank中报道的Bo NT/A LC基因序列设计特异引物,从肉毒梭菌中扩增Bo NT/A LC基因片段,构建重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,... 详细信息

目的:在大肠杆菌中表达、纯化A型肉毒毒素轻链(Bo NT/A LC),研究其生物学活性。方法:根据Gen Bank中报道的Bo NT/A LC基因序列设计特异引物,从肉毒梭菌中扩增Bo NT/A LC基因片段,构建重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,IPTG诱导目的蛋白高效表达,表达产物经Ni螯合亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,并利用相应底物对纯化产物进行生物活性分析和酶活动力学测定。结果与结论:构建了重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,原核表达获得高水平可溶性重组Bo NT/A LC,纯化得到纯度较高的蛋白质,重组Bo NT/A LC的酶活略高于A型肉毒毒素全毒素,可作为试剂用于Bo NT/A LC抑制剂高通量体外检测方法研究。

关键词： A型肉毒毒素轻链金属内肽酶原核表达

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复发性阿弗他溃疡自身免疫的分子模拟机制

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检验医学与临床 2015年第A02期12卷 4-6页

作者：姜军松黄华东杨志刚荫俊范学东韩华朱佳汪庆庚若琪王丹解放军98医院口腔黏膜病科 313000 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的：本研究旨在探查复发性阿弗他溃疡（RAU ）患者 T 细胞识别热休克蛋白（HSP）的抗原表位。方法采用从结核分枝杆菌65kD HSP 获得的小肽段刺激外周血单个核细胞，做淋巴细胞增殖试验确定 T 细胞表位。结果 RAU 患者只对65kD HSP91‐... 详细信息

目的：本研究旨在探查复发性阿弗他溃疡（RAU ）患者 T 细胞识别热休克蛋白（HSP）的抗原表位。方法采用从结核分枝杆菌65kD HSP 获得的小肽段刺激外周血单个核细胞，做淋巴细胞增殖试验确定 T 细胞表位。结果 RAU 患者只对65kD HSP91‐105肽段起明显的特异性淋巴细胞增殖反应（P ＜0．01）；对人类同源性60kD HSP91‐130肽段的对比研究表明 RAU 患者对照组有更显著的淋巴细胞增殖反应（P＜0．01）。结论本研究提示 RAU 可能由口腔微生物 HSP91‐105肽段刺激口腔黏膜郎罕氏细胞所启动，通过分子模拟使针对同源性HSP116‐130肽段的自身反应性 T 细胞克隆增殖。

关键词：阿弗他口炎热休克蛋白自身免疫分子模拟

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