目的:构建本室新分离的登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,为深入研究登革病毒致病机制奠定基础。方法:根据登革1型病毒广州06株基因组全序列中单一酶切位点设计特异引物,分别扩增并克隆5个病毒亚基因组cDNA片段,将其逐一拼接连入pW SK 29低拷贝质粒载体,获得病毒全长cDNA克隆,并将其体外转录为RNA,再转染细胞获得恢复病毒。进一步通过RT-PCR扩增病毒5′和3′非编码区序列和特异性间接免疫荧光对其恢复病毒进行鉴定。结果和结论:构建获得登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,其恢复病毒与野生型病毒具有相似的生物学特性。
目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准...
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目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。
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