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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第11期27卷 1037-1040页

作者：刘志国朱晓光杨保安刘伯华祝庆余军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的研究西尼罗病毒（WNV）多表位基因的融合表达及其免疫保护作用。方法利用生物信息软件Biosun分析西尼罗全基因序列，确定表位基因片段并选择合适片段连接构成多表位基因。采用重叠PCR方法扩增该基因，构建多表位基因的原核重组表达... 详细信息

目的研究西尼罗病毒（WNV）多表位基因的融合表达及其免疫保护作用。方法利用生物信息软件Biosun分析西尼罗全基因序列，确定表位基因片段并选择合适片段连接构成多表位基因。采用重叠PCR方法扩增该基因，构建多表位基因的原核重组表达载体pET-43a-M，进行融合表达和纯化。将表达蛋白加弗氏佐剂免疫小鼠并进行攻毒试验，观察其保护作用。结果分子克隆和构建了原核重组表达质粒pET-43a-M，表达和纯化了融合蛋白Nus-M，该蛋白免疫后的小鼠能够部分抵御西尼罗病毒的攻击。结论构建的西尼罗病毒多表位基因能够在原核细胞内表达，表达产物有较弱的免疫保护反应，为该病毒多表位抗原的串联及多表位疫苗研究提供了试验资料，但需要进一步改进。

关键词：西尼罗病毒多表位基因免疫保护

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鼠疫亚单位疫苗的免疫学效果评价

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中华预防医学杂志 2009年第9期43卷 785-788页

作者：张青雯祁芝珍辛有全杨永海吴海莲杨汉青冯建萍金星崔百忠王棠吴本传邱业峰王旺郭兆彪王祖郧杨瑞馥王虎王效义青海省地方病预防控制所西宁811602 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室军事医学科学院微生物流行病研究所生物工程研究所军事医学科学院微生物流行病研究所实验动物中心

目的分别以小鼠、豚鼠和兔为实验动物，比较其在评价鼠疫亚单位疫苗免疫保护中的差别。方法分别以Fl＋rV270鼠疫亚单位疫苗、EV76减毒活疫苗和铝佐剂肌内注射免疫BALB／c小鼠（每组10只）、豚鼠（每组14只）和兔（每组6只）。初次免疫后... 详细信息

目的分别以小鼠、豚鼠和兔为实验动物，比较其在评价鼠疫亚单位疫苗免疫保护中的差别。方法分别以Fl＋rV270鼠疫亚单位疫苗、EV76减毒活疫苗和铝佐剂肌内注射免疫BALB／c小鼠（每组10只）、豚鼠（每组14只）和兔（每组6只）。初次免疫后第8周采血，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测IgG抗体滴度和皮下感染10^6 CFU鼠疫菌141强毒株测定保护率。结果亚单位疫苗免疫小鼠、豚鼠和兔产生的F1 IgG抗体滴度分别为41587．3±2．1、11543．7±2．1、522．4±22．4，差异有统计学意义（F=17．58，P〈0．01）；产生的rV270 IgG抗体滴度分别为15748．7±1．6、12．6±1．4、1648．0±5．0，差异有统计学意义（F=16．34，P〈0．01）。EV76免疫的小鼠、豚鼠和兔产生的F1IgG抗体滴度分别为913．4±4．5、937．0±2．0、342．0±12．0，差异有统计学意义（F=23．67，P〈0．01），而EV76免疫的小鼠、豚鼠和兔产生的rV270IgG抗体滴度分别为12．0±1．0、447．0±10．0、40．0±11．0，差异无统计学意义（F=2．20，P=0．13）。亚单位疫苗免疫小鼠F1IgG抗体滴度均明显高于豚鼠和兔（q值分别为30．57、19．04，P〈0．01），豚鼠与兔产生的F1 IgG抗体滴度差异无统计学意义（q=0．04，P=0．85）；亚单位疫苗免疫小鼠的rV270IgG抗体均明显高于豚鼠和兔（q值分别为27．10、19．49，P〈0．01），而豚鼠与兔产生的rV270 IgG抗体滴度差异无统计学意义（q=0．25，P=0．62）。EV76疫苗免疫的小鼠产生的F1IgG抗体滴度明显高于豚鼠和兔（q值分别为40．67、29．10，P〈0．01），而豚鼠和兔产生的F1IgG抗体滴度的差异无统计学意义（q=0．06，P=0．81）。亚单位疫苗免疫的小鼠、豚鼠和兔免疫保护率分别为100％（10／10）、86％（12／14）和100％（5／5）；EV76疫苗免疫的小鼠、豚鼠和兔免疫保护率分别为100％（6／6）、93％（13／14）和100％（6／6）。结论BALB／c小鼠是较好的评价鼠疫亚单位疫苗的小型动物；豚鼠评价鼠疫亚单位疫苗存在较大个体差异；兔也可用作评价鼠疫亚单位疫苗的动物。

关键词：耶尔森菌,鼠疫鼠疫菌苗免疫小鼠豚鼠兔

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立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

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中华流行病学杂志 2006年第6期27卷 526-529页

作者：牛东升陈梅玲温博海李青凤邱玲张晶波军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的采用TaqMan-MGB探针建立立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法依据立氏立克次体外膜蛋白B基因序列设计引物和探针,以克隆的ompB基因片段为DNA模板,在ABI 7900型荧光定量PCR检测仪上建立实时荧光定量PCR检测方... 详细信息

目的采用TaqMan-MGB探针建立立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法依据立氏立克次体外膜蛋白B基因序列设计引物和探针,以克隆的ompB基因片段为DNA模板,在ABI 7900型荧光定量PCR检测仪上建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数呈线性关系(R2=0．996),最低检测浓度为5拷贝／μl;用荧光定量PCR方法检测其他相关立克次体和常见非立克次体病原菌,检出结果均为阴性。用该方法检测立氏立克次体感染的豚鼠血液标本、小鼠脾脏标本及细胞培养标本,检测的结果与立氏立克次体感染相关。结论研究建立的检测立氏立克次体实时荧光定量PCR方法具有高特异性和高敏感性,适用于快速检测各种样本中的立氏立克次体和立氏立克次体感染早期的实验室诊断。

关键词：立氏立克次体实时荧光定量,聚合酶链反应敏感性特异性

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中国大林姬鼠携带Amur类汉坦病毒及其分子生物学特征分析

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中华流行病学杂志 2007年第5期28卷 482-486页

作者：张文义江佳富姚昆吴晓明左曙青詹琳褚宸一赵秋敏张泮河杨红曹务春军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的确定中国大林姬鼠是否存在Amur类汉坦病毒及其分子生物学特征。方法应用RT-PCR法扩增大林姬鼠肺组织中汉坦病毒M基因片段和S基因全长,目的片段经测定其核苷酸序列后,用DNASTAR软件进行同源性比对和系统发育分析。结果从东北大林... 详细信息

目的确定中国大林姬鼠是否存在Amur类汉坦病毒及其分子生物学特征。方法应用RT-PCR法扩增大林姬鼠肺组织中汉坦病毒M基因片段和S基因全长,目的片段经测定其核苷酸序列后,用DNASTAR软件进行同源性比对和系统发育分析。结果从东北大林姬鼠肺标本JilinAP06中分别扩增出长度383 bp（M基因）和1696 bp（S基因）大小的目的eDNA片段,其S基因全长由1696个核苷酸组成,完整的开放阅读框从37位核苷酸至1323位核苷酸,共1287个核苷酸,编码429个氨基酸的蛋白。JilinAP06 S基因与1378、Liu株同源性最高,与H5株同源性次之,与AP63、AP61和AP1371同源性为91．0%～91．7%,与76．118同源性为81．0%。S全序列基因推导的氨基酸序列与其他汉坦病毒已知序列比较显示：JilinAP06与AP1371同源性最高（98．4%）,与AP61同源性为98．1%,与AP63和Liu、B78和H5株同源性为97．2%～97．9%,与76-118同源性为95．1%。系统发育分析结果显示：JilinAP06与Amur类汉坦病毒构成一个相对独立的分支。M基因片段同源性比较和系统发育分分析结果与基于S基因全长得到的结果一致.结论中国大林姬鼠存在Amur类病毒，大林姬鼠很可能为Amur类病毒的自然宿主和人群Amur类病毒感染的重要来源。

关键词：汉坦病毒 Amur病毒大林姬鼠

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TBEV对人神经细胞致病性的实验研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2012年第5期32卷 415-418页

作者：魏婧靖李裕昌吴晓燕司炳银张雨李靖户义祝庆余杨银辉康晓平军事医学科学院微生物流行病研究所、病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的确定蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus，TBEV）对人神经母瘤细胞的感染性及复制增殖情况。方法将TBEV感染人神经母瘤细胞SK－N－SH，取不同时间点的细胞培养上清，分别采用real－timeRT－PCR方法及空斑测定的方法测定... 详细信息

目的确定蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus，TBEV）对人神经母瘤细胞的感染性及复制增殖情况。方法将TBEV感染人神经母瘤细胞SK－N－SH，取不同时间点的细胞培养上清，分别采用real－timeRT－PCR方法及空斑测定的方法测定病毒滴度，以确定TBEV在SK－N－SH细胞中的复制增殖情况；同时进行细胞形态观察及免疫荧光检测，以确定TBEV感染后的SK－N－SH细胞形态变化。结果TBEV感染SK－N－SH细胞后，可进行大量复制增殖，感染后3d，病毒滴度达到峰值，可达2．92×10＾7PFU／ml，感染细胞产生明显的形态改变，免疫荧光法可检测到细胞内的病毒粒子。结论TBEV可在人神经母瘤细胞SK－N－SH中大量复制增殖，并可造成细胞明显的形态改变，因此人神经母瘤细胞SK-N-SH可以作为TBEV培养良好的细胞模型。

关键词：蜱传脑炎病毒神经细胞致病性

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大肠埃希菌的群体基因组学研究

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中华预防医学杂志 2016年第6期50卷 554-558页

作者：武雅蓉杨瑞馥崔玉军军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

将群体遗传学的理论与方法应用于特定种群多个分离株的全基因组序列中，进行数据挖掘和分析的学科称为群体基因组学（population genomics）。近年来，测序技术的迅猛发展使得低成本、快速获得大量个体全基因组序列成为可能，这推动了... 详细信息

将群体遗传学的理论与方法应用于特定种群多个分离株的全基因组序列中，进行数据挖掘和分析的学科称为群体基因组学（population genomics）。近年来，测序技术的迅猛发展使得低成本、快速获得大量个体全基因组序列成为可能，这推动了群体基因组学在进化领域的广泛应用。本文以经典模式生物大肠埃希菌为例，回顾了大肠埃希菌A、B1、B2、D和E五个基因型之间进化关系的确立历程；总结了基因组突变率、选择信号以及适应性进化模式的分析实例；并对群体基因组学在应对O157：H7和O104：H4菌株所致疫情暴发中的应用进行了综述。这些研究结果说明，尽管发展时间较短，群体基因组学在解析细菌种群结构、探索进化规律以及疾病暴发应对等领域已经发挥了重要作用；加强该学科研究对大肠埃希菌以及其他病原细菌的进化与防控研究工作均有积极意义。

关键词：大肠杆菌基因组遗传学,群体种群结构流行病学

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人源抗狂犬病毒单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达

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微生物学报 2007年第4期47卷 673-676页

作者：蔡昆王慧包士中史晶侯晓军荫俊军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

以人源抗狂犬病毒糖蛋白母本单链抗体ScFv为模板,利用PCR点突变分别在重链FR可变区VH(44)和轻链FR可变区VL(100)分别引入一个半胱氨酸,成功构建了重组单链二硫键稳定抗体基因。连接pET22b(+)载体,转化入*** BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱... 详细信息

以人源抗狂犬病毒糖蛋白母本单链抗体ScFv为模板,利用PCR点突变分别在重链FR可变区VH(44)和轻链FR可变区VL(100)分别引入一个半胱氨酸,成功构建了重组单链二硫键稳定抗体基因。连接pET22b(+)载体,转化入*** BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱导表达。体外复性并经Ni-NTA亲和层析对目的蛋白ScdsFv进行纯化;利用荧光抗体实验和ELISA检测抗体活性及稳定性。结果表明重组ScdsFv蛋白实现了原核高效表达,通过体外复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度大于90%的ScdsFv蛋白。荧光抗体实验和ELISA结果表明ScdsFv具有特异的抗原结合活性,与母本ScFv比较,稳定性有明显提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定ScdsFv蛋白的获得为其进一步的功能研究提供了材料。

关键词：狂犬病毒单链二硫键稳定抗体表达

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两株炭疽芽胞杆菌MLST新序列型(ST)

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微生物学报 2012年第1期52卷 120-123页

作者：左庭婷李岩伟韩雪莲何君端青军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

【目的】2株炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)17003-14和17003-32的多位点序列分型(Multilocussequence typing,MLST)研究。【方法】选取***基因组7个常见管家基因位点glpF、gmk、ilvD、pta、pur、pycA和tpi进行PCR扩增、测序,与MLST数据库中的等位基因序列进行比对,确定菌株的序列型(sequence type,ST)。【结果】*** 17003-14和17003-32的等位基因编号分别为113、31、1、43、1、53、7和113、31、1、43、1、53、37,比对结果显示这2株细菌的等位基因编号组合未见报道。【结论】17003-14和17003-32为新ST菌株,已被MLST数据库确认,注册号(pubMLST id)分别为id-1053和id-1054。

关键词：炭疽芽胞杆菌多位点序列分型序列型基因分型

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衣壳蛋白缺失突变登革病毒的制备与鉴定

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南方医科大学学报 2007年第1期27卷 31-34,37页

作者：朱武洋秦鄂德于曼秦成峰于学东军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的制备登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的衣壳蛋白缺失突变病毒。方法在DEN2-43株病毒感染性全长cDNA克隆的基础之上,利用融合PCR技术构建衣壳蛋白基因缺失的全长cDNA,将其线性化并体外转录成RNA后,经电穿孔法导入宿主细胞获得衣壳蛋... 详细信息

目的制备登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的衣壳蛋白缺失突变病毒。方法在DEN2-43株病毒感染性全长cDNA克隆的基础之上,利用融合PCR技术构建衣壳蛋白基因缺失的全长cDNA,将其线性化并体外转录成RNA后,经电穿孔法导入宿主细胞获得衣壳蛋白缺失突变病毒。结果序列比对表明,所获得的恢复病毒带有与预期一致的缺失突变。结论成功制备衣壳蛋白缺失突变病毒,为进一步研究衣壳蛋白基因突变对登革病毒生物学特性的影响奠定了基础。

关键词：登革病毒感染性全长cDNA克隆缺失突变病毒

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四川省资阳市爆发的猪链球菌感染疫情中病原菌的分离和鉴定

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微生物学报 2006年第4期46卷 635-638,I0003页

作者：朱虹何君荆红波王争强端青姜永强苏裕心军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

对四川资阳地区病猪标本、尸检肝标本和血清标本进行病原菌分离,得到10株分离菌。经菌落形态和菌体形态观察、生化鉴定,证明其中3株为猪链球菌2型(SS2)。通过对3株SS2胞外因子基因、溶菌酶释放蛋白基因、荚膜多糖基因和16S rRNA基因进行... 详细信息

对四川资阳地区病猪标本、尸检肝标本和血清标本进行病原菌分离,得到10株分离菌。经菌落形态和菌体形态观察、生化鉴定,证明其中3株为猪链球菌2型(SS2)。通过对3株SS2胞外因子基因、溶菌酶释放蛋白基因、荚膜多糖基因和16S rRNA基因进行PCR扩增,结果分别在626bp8、85bp4、87bp和297bp处出现目的条带。为进一步了解分离的SS2菌株的特性,使用VITEK GPS-107药敏卡进行药敏试验,结果表明分离菌对青霉素-G、红霉素、万古霉素等多种抗生素敏感。分离菌感染Balb/c小鼠可引起动物死亡,并出现胃肠肿胀、嘴部青紫以及皮下紫斑等症状,与患者症状相似,小鼠脏器压片经革兰氏染色镜下观察可见阳性球菌。

关键词：猪链球菌2型生化鉴定 PCR扩增药敏试验动物试验

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