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中国动物学会寄生虫学专业委员会第十五次全国学术会议暨第六次国际寄生虫学学术研讨会

作者：吴群李春晓韩谦赵彤言海南大学军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室

目的:随着生物技术的快速发展,很多新的技术被应用到蚊虫嗅觉蛋白基因的功能研究中,其中RNA干扰技术(RNAi)的应用,加快了基因功能的研究,将RNAi应用于蚊虫气味受体基因的研究,最关键的是怎样将ds RNA导入蚊虫体内,目前应用最多方法为显... 详细信息

目的:随着生物技术的快速发展,很多新的技术被应用到蚊虫嗅觉蛋白基因的功能研究中,其中RNA干扰技术(RNAi)的应用,加快了基因功能的研究,将RNAi应用于蚊虫气味受体基因的研究,最关键的是怎样将ds RNA导入蚊虫体内,目前应用最多方法为显微注射,显微注射成功与否对蚊虫RNA干扰实验至关重要。本研究以致倦库蚊成蚊为注射对象来研究最佳显微注射方法。方法:选取羽化后的蚊虫进行冰冻,通过冰冻时间长短来确定最佳麻醉蚊虫时间,然后对其进行注射,通过注射蚊虫胸部不同位置来确定最佳注射位置,注射时通过注射不同体积来确定最佳注射体积,最后通过综合计算蚊虫的成活率来获得最佳注射方案。结果:蚊虫冰冻4min能达到最佳麻醉效果。时间低于4min蚊虫能快速恢复,高于4min中达到5min时虽然蚊虫恢复时间要比4min更长有利于注射,但能对蚊虫造成伤害,死亡率达到了17.13%,正对胸部注射蚊虫的成活率(65%)低于从侧面注射的成活率(93.5%),当注射量达到1μL时可以明显观察到雌蚊腹部明显变化并不影响其成活率。结论:通过实验得出的最佳蚊虫微量注射方法为:选取羽化3-5天蚊虫冰冻4min放置与冰盒上从蚊虫胸部侧面注入1μL液体于蚊虫体内。

关键词： RNAi 蚊虫微量注射

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质粒介导碳青霉烯耐药机制研究

质粒介导碳青霉烯耐药机制研究

引用

2015年中国微生物学会学术年会

作者：周冬生邱业峰殷喆冯娇军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室军事医学科学院实验动物中心

碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广、抗菌活性最强的非典型β-内酰胺类抗菌药物,因具有对β-内酰胺酶稳定、毒性低、见效快、预后好等特点,已经成为治疗危重感染或初始抗生素治疗失败的复杂感染的最常用抗菌药物之一.但是,由于近年来碳青霉...

碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广、抗菌活性最强的非典型β-内酰胺类抗菌药物,因具有对β-内酰胺酶稳定、毒性低、见效快、预后好等特点,已经成为治疗危重感染或初始抗生素治疗失败的复杂感染的最常用抗菌药物之一.但是,由于近年来碳青霉烯类抗生素在临床上的广泛应用及不合理使用,临床上已有不动杆菌、假单胞菌、肠杆菌科细菌等为主的碳青霉烯耐药菌出现和蔓延,使得临床抗感染治疗面临着前所未有的严峻挑战.

关键词：

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肠出血性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统ATP水解酶escN基因突变株的构建

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生物技术通讯 2015年第3期26卷 346-348页

作者：陈芳红李涛王慧安徽医科大学安徽合肥2300322 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的:利用λ噬菌体的Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的Ⅲ型分泌系统ATP水解酶Esc N,构建大肠杆菌esc N基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别酶切连接于p UC19-kan质粒上,PCR获得中间... 详细信息

目的:利用λ噬菌体的Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的Ⅲ型分泌系统ATP水解酶Esc N,构建大肠杆菌esc N基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别酶切连接于p UC19-kan质粒上,PCR获得中间嵌合卡那霉素抗性基因(带有FRT位点)的同源线性片段,利用质粒p KD46和p CP20介导的重组技术敲除esc N基因,并去除抗性标记;PCR及测序验证目的基因缺失后,测定缺失株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的esc N基因,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:构建了Ⅲ型分泌系统缺陷菌株,为进一步研究Ⅲ型分泌系统因子在肠出血性大肠杆菌致病过程中的作用奠定了基础。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157∶H7 Ⅲ型分泌系统 Red重组系统

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致倦库蚊卵黄羧前体基因的克隆及定量分析

致倦库蚊卵黄羧前体基因的克隆及定量分析

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中国动物学会寄生虫学专业委员会第十五次全国学术会议暨第六次国际寄生虫学学术研讨会

作者：刘钦梅李春晓赵彤言韩谦刁晓平海南大学农学院军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室

目的:本文克隆致倦库蚊卵黄酸前体基因,并分析其是否与抗药性相关。方法:通过幼虫生物测定方法,得到致倦库蚊实验室敏感株、三亚野外抗性株和三亚药物筛选株各自LC50。同时设计特异性引物,PCR扩增得到致倦库蚊卵黄酸前体基因片段,采用S... 详细信息

目的:本文克隆致倦库蚊卵黄酸前体基因,并分析其是否与抗药性相关。方法:通过幼虫生物测定方法,得到致倦库蚊实验室敏感株、三亚野外抗性株和三亚药物筛选株各自LC50。同时设计特异性引物,PCR扩增得到致倦库蚊卵黄酸前体基因片段,采用SYBR荧光定量方法,以致倦库蚊核糖体蛋白L8基因作为内参,比较了卵黄酸前体基因在实验室敏感株、三亚野外抗性株和三亚药物筛选株表达量的差异。结果:致倦库蚊实验室敏感株、三亚野外抗性株和三亚药物筛选株的LC50从低到高;而卵黄酸前体基因在实验室敏感株表达量最高,三亚药物筛选株表达量最低,在三亚野外抗性株的表达量介于实验室敏感株和三亚药物筛选株之间。致倦库蚊的抗药性越高,卵黄酸前体基因的表达量越低;两者之间存在着负相关关系。结论:抗药性不同的致倦库蚊卵黄酸前体基因的表达量不同,推测卵黄酸前体基因为致倦库蚊抗性相关的新基因,为研究致倦库蚊的抗药性提供了新的方向。

关键词：致倦库蚊抗药性卵黄羧前体基因实时定量PCR

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A型肉毒毒素轻链的原核表达、纯化及活性鉴定

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生物技术通讯 2015年第5期26卷 632-635页

作者：罗森齐芬芳宫路路刘昊李涛王慧遵义医药高等专科学校贵州遵义563002 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的:在大肠杆菌中表达、纯化A型肉毒毒素轻链(Bo NT/A LC),研究其生物学活性。方法:根据Gen Bank中报道的Bo NT/A LC基因序列设计特异引物,从肉毒梭菌中扩增Bo NT/A LC基因片段,构建重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,... 详细信息

目的:在大肠杆菌中表达、纯化A型肉毒毒素轻链(Bo NT/A LC),研究其生物学活性。方法:根据Gen Bank中报道的Bo NT/A LC基因序列设计特异引物,从肉毒梭菌中扩增Bo NT/A LC基因片段,构建重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,IPTG诱导目的蛋白高效表达,表达产物经Ni螯合亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,并利用相应底物对纯化产物进行生物活性分析和酶活动力学测定。结果与结论:构建了重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,原核表达获得高水平可溶性重组Bo NT/A LC,纯化得到纯度较高的蛋白质,重组Bo NT/A LC的酶活略高于A型肉毒毒素全毒素,可作为试剂用于Bo NT/A LC抑制剂高通量体外检测方法研究。

关键词： A型肉毒毒素轻链金属内肽酶原核表达

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复发性阿弗他溃疡自身免疫的分子模拟机制

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检验医学与临床 2015年第A02期12卷 4-6页

作者：姜军松黄华东杨志刚荫俊范学东韩华朱佳汪庆庚若琪王丹解放军98医院口腔黏膜病科 313000 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的：本研究旨在探查复发性阿弗他溃疡（RAU ）患者 T 细胞识别热休克蛋白（HSP）的抗原表位。方法采用从结核分枝杆菌65kD HSP 获得的小肽段刺激外周血单个核细胞，做淋巴细胞增殖试验确定 T 细胞表位。结果 RAU 患者只对65kD HSP91‐... 详细信息

目的：本研究旨在探查复发性阿弗他溃疡（RAU ）患者 T 细胞识别热休克蛋白（HSP）的抗原表位。方法采用从结核分枝杆菌65kD HSP 获得的小肽段刺激外周血单个核细胞，做淋巴细胞增殖试验确定 T 细胞表位。结果 RAU 患者只对65kD HSP91‐105肽段起明显的特异性淋巴细胞增殖反应（P ＜0．01）；对人类同源性60kD HSP91‐130肽段的对比研究表明 RAU 患者对照组有更显著的淋巴细胞增殖反应（P＜0．01）。结论本研究提示 RAU 可能由口腔微生物 HSP91‐105肽段刺激口腔黏膜郎罕氏细胞所启动，通过分子模拟使针对同源性HSP116‐130肽段的自身反应性 T 细胞克隆增殖。

关键词：阿弗他口炎热休克蛋白自身免疫分子模拟

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河南驻马店市性传播HIV感染者中流行的HIV亚型分析

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中国艾滋病性病 2015年第10期21卷 839-842页

作者：孙国清韩婧婉崔海燕桂滔刘永健李韩平李天一王晓林鲍作义庄道民刘思扬李敬云李林河南省疾病预防控制中心郑州450016 军事医学科学院微生物流行病研究所全军艾滋病检测中心病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 驻马店市疾病预防控制中心河南驻马店463000

目的分析河南驻马店市经性传播的艾滋病病毒(HIV)感染者中,HIV流行毒株亚型及其毒株特征。方法通过专业问卷调查,了解驻马店地区经性传播HIV感染者的基本状况。采集感染者的EDTA抗凝静脉血,检测其CD+4T淋巴细胞(简称CD4细胞)计数,提取... 详细信息

目的分析河南驻马店市经性传播的艾滋病病毒(HIV)感染者中,HIV流行毒株亚型及其毒株特征。方法通过专业问卷调查,了解驻马店地区经性传播HIV感染者的基本状况。采集感染者的EDTA抗凝静脉血,检测其CD+4T淋巴细胞(简称CD4细胞)计数,提取外周血浆中病毒核糖核酸(RNA),使用反转录巢式荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法扩增病毒全长gag和部分pol基因,利用Clustal软件比对序列,利用BioEdit软件手工校对,利用NCBI网站HIV分型工具分析病毒亚型,利用MEGA软件构建NJ树,分析病毒系统进化关系。结果共收集到HIV感染者血液74份,全部经性传播感染HIV。经过测序,共获得HIV全长gag基因56条(75.7%),全长pol基因38条(51.4%)。对61例HIV感染者感染病毒亚型进行了分析,其中B亚型毒株47例(77.0%),CRF01_AE毒株6例(9.8%),CRF07_BC毒株4例(6.6%),C亚型毒株2例(3.3%),新型重组毒株2例(3.3%)。系统进化分析显示,所有的B亚型毒株均为Thai B毒株。38例获得pol区序列的样本中,有4例具有耐药突变。结论驻马店市性传播HIV感染者中流行的HIV毒株构成复杂,Thai B亚型毒株是优势毒株,CRF01_AE、CRF07_BC、C等亚型毒株均已进入该人群,而且出现了新型重组毒株。针对该人群的HIV流行毒株监测至关重要。

关键词：艾滋病病毒性传播流行毒株亚型系统进化分析

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阜康细蠓新种描述

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中华卫生杀虫药械 2015年第2期21卷 173-174页

作者：陈联宏阿依肯虞以新昌吉州疾疾病预防中心新疆昌吉831100 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的调查昌吉地区吸血蠓的种类分布和分类。方法采用网捕法采集。结果采获2种细蠓,经分类鉴定为二齿细蠓及一细蠓新种,定名为阜康细蠓(模式标本都珍藏于医学昆虫标本馆)。结论为中国细蠓属的种类分布和分类研究提供了科学依据。

关键词：蠓科细蠓新种

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黑龙江立克次体重组外膜蛋白B激活树突状细胞诱导C3H/HeN小鼠特异性免疫应答

引用

中国科学：生命科学 2014年第3期44卷 889-898页

作者：孟艳芬熊小路齐永段长松龚文平焦俊温博海中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

专性胞内寄生的黑龙江立克次体是远东斑点热的病原体,外膜蛋白B(OmpB)是其最主要的表面蛋白抗原.本研究将黑龙江立克次体ompB基因分成4段插入原核表达载体,制备出4个重组OmpB抗原(OmpB-P1,OmpB-P2,OmpB-P3和OmpB-P4).将4个重组OmpB抗原... 详细信息

专性胞内寄生的黑龙江立克次体是远东斑点热的病原体,外膜蛋白B(OmpB)是其最主要的表面蛋白抗原.本研究将黑龙江立克次体ompB基因分成4段插入原核表达载体,制备出4个重组OmpB抗原(OmpB-P1,OmpB-P2,OmpB-P3和OmpB-P4).将4个重组OmpB抗原分别刺激体外培养的C3H/HeN小鼠树突状细胞,再将这些抗原激活树突状细胞分别腹腔接种正常C3H/HeN小鼠.接种第14天用黑龙江立克次体攻击小鼠,7天后活杀小鼠并用实时定量PCR检测小鼠主要脏器的立克次体的载量.结果显示,OmpB-P2,OmpB-P3或OmpB-P4激活树突状细胞受体小鼠的立克次体载量显著低于OmpB-P1激活树突状细胞受体小鼠.将不同抗原激活小鼠树突状细胞分别与同源抗原激活小鼠树突状细胞受体小鼠的CD4+和CD8+T细胞体外共培养.用流式细胞仪分析共培养后CD4+和CD8+T细胞的表面分子和细胞因子表达,结果显示,OmpB-P2,OmpB-P3或OmpB-P4抗原激活树突状细胞共培养的CD4+或CD8+T细胞的CD69表达水平高于OmpB-P1激活树突状细胞共培养的T细胞.此外,OmpB-P2,OmpB-P3或OmpB-P4激活树突状细胞共培养的CD4+或CD8+T细胞的TNF-?和IFN-?水平均显著高于OmpB-P1激活树突状细胞共培养的T细胞.本研究结果表明,OmpB-P2,OmpB-P3或OmpB-P4为保护性抗原,其激活的树突状细胞可以有效地诱导T淋巴细胞活化,使CD4+T细胞和CD8+T细胞分别向Th1细胞和Tc1细胞分化,产生高水平TNF-?和IFN-?共同对抗立克次体感染.

关键词：黑龙江立克次体树突状细胞外膜蛋白保护性免疫

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沙眼衣原体质粒调控基因的上游序列有广泛的ChxR结合位点

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生物技术通讯 2015年第4期26卷 501-504页

作者：李鹏于永慧王涛何君朱虹端青宋立华病原微生物生物安全国家重点实验室军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071 解放军第264医院山西太原030001

目的:利用凝胶阻滞实验分析沙眼衣原体质粒调控基因的上游DNA序列与ChxR 的相互作用;方法:利用表达载体p ET-21b在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达ChxR ,重组蛋白的N端有T7标签、C端有6×His标签,用TALON金属亲和介质纯化重组蛋白;PCR... 详细信息

目的:利用凝胶阻滞实验分析沙眼衣原体质粒调控基因的上游DNA序列与ChxR 的相互作用;方法:利用表达载体p ET-21b在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达ChxR ,重组蛋白的N端有T7标签、C端有6×His标签,用TALON金属亲和介质纯化重组蛋白;PCR扩增沙眼衣原体质粒调控基因的上游区约150 bp,连接p CR2.1载体,重组载体经单酶切,制备3'端生物素标记探针;用引物延伸实验确定glgA的转录起始位点,并合成5条glgA上游区的30 bp重叠探针;用凝胶阻滞实验分析ChxR 与以上探针的相互作用。结果:4个质粒调控基因的上游均有多个ChxR 结合位点,特别是glgA上游区至少有6个结合位点;glgA上游的ChxR 结合位点多位于启动子和启动子下游区。结论:ChxR 可能参与质粒调控基因的转录;在glgA转录中,ChxR 可能起转录抑制子的作用。

关键词：沙眼衣原体质粒 ChxR Pgp4 glgA 基因调控

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