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色谱 2012年第3期30卷 239-244页

作者：王雪颖秦伟捷钱小红张养军沈阳药科大学辽宁沈阳110015 蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京102206

建立了氨基酸同位素稀释液相色谱-串联质谱法准确测定合成肽段绝对含量的方法。实验中对合成肽段的纯度进行了表征,色谱纯度表征结果为99%以上,质谱纯度为90%以上。在肽段溶液中加入13C标记的氨基酸后进行酸溶液水解时间的优化,水解后... 详细信息

建立了氨基酸同位素稀释液相色谱-串联质谱法准确测定合成肽段绝对含量的方法。实验中对合成肽段的纯度进行了表征,色谱纯度表征结果为99%以上,质谱纯度为90%以上。在肽段溶液中加入13C标记的氨基酸后进行酸溶液水解时间的优化,水解后的氨基酸直接经液相色谱分离和质谱检测,结果表明肽段中的被测氨基酸在150℃、6 mol/L HCl溶液水解4～6 h就可以达到水解平衡。每个肽段选择两个或两个以上的被测氨基酸,测得随机选择的5种合成肽段的绝对含量为62.07%～88.18%,测定结果的相对标准偏差小于8%,相对误差小于5%,均满足定量要求。除常用的被测氨基酸苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸外,还考察了选择赖氨酸和精氨酸作为被测氨基酸的可行性,实验结果表明增加精氨酸为被测氨基酸是可行的,从而进一步增加了方法的普适性。该方法的建立避免了色谱法定量时氨基酸衍生化处理带来的副反应影响及操作繁琐等问题,提高了肽段含量测定的准确度和精密度,为肽段含量的准确测定提供了一种新的方法。

关键词：液相色谱同位素稀释质谱法合成肽段氨基酸分析

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依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法的建立及其初步应用

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色谱 2012年第2期30卷 170-177页

作者：毛心丽卫军营牛明周廉淇王雪颖佟巍秦伟捷张养军钱小红沈阳药科大学辽宁沈阳110015 蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京102206

建立了依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法,并与非依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱分析方法对不同体系(牛血清白蛋白酶切物、6种标准蛋白质混合物酶切物、腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)的分析结果进行了系统比较。... 详细信息

建立了依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法,并与非依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱分析方法对不同体系(牛血清白蛋白酶切物、6种标准蛋白质混合物酶切物、腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)的分析结果进行了系统比较。结果表明,引入色谱保留时间后的智能化选择反应监测质谱方法能够显著提高肽段及蛋白质的鉴定量,并且在复杂体系(如腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)中效果尤为明显,鉴定到的肽段及蛋白质的覆盖率可分别达到目标肽段和蛋白质数量的89.62%和92.41%,并且灵敏度高、重复性好,能够实现对质荷比相同但保留时间有差异的肽段的准确鉴定。该方法将在复杂生物样本目标蛋白质组高通量、高灵敏度的鉴定、验证和确认中发挥独特作用。

关键词：液相色谱保留时间智能化选择反应监测质谱目标蛋白质组学腾冲嗜热菌

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一种蛋白质B细胞表位展示系统的构建及验证

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中国生物工程杂志 2012年第6期32卷 64-68页

作者：刘英富霍景瑞范国才孙志贤王清明蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京102206

目的:建立一种能够有效展示蛋白质B细胞表位的载体系统,以用于表位特异性抗体的制备和表位疫苗的设计。方法:选用抗体的可变区作为蛋白质B细胞表位展示的骨架蛋白,B细胞表位的展示部位为CDR3区。全基因合成骨架蛋白基因,通过重叠PCR将B... 详细信息

目的:建立一种能够有效展示蛋白质B细胞表位的载体系统,以用于表位特异性抗体的制备和表位疫苗的设计。方法:选用抗体的可变区作为蛋白质B细胞表位展示的骨架蛋白,B细胞表位的展示部位为CDR3区。全基因合成骨架蛋白基因,通过重叠PCR将B细胞表位编码序列插入到骨架蛋白基因中,原核表达目的蛋白,利用Sephacryl S-100层析柱进行蛋白纯化,用纯化的蛋白按常规方法免疫小鼠,采用ELISA法检测免疫血清的滴度及特异性,通过Western blot和间接免疫荧光技术进一步验证免疫血清对目的蛋白的识别。结果:成功构建了3种表位展示蛋白,均表现出了很好的抗原性,表位展示蛋白免疫血清具有较好的特异性,能够特异识别所展示的B细胞表位。结论:抗体可变区作为骨架蛋白能够很好地展示B细胞表位,免疫小鼠后获得的免疫血清表现出了较好的特异性。

关键词： B细胞表位骨架蛋白抗血清

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质谱智能选择反应监测用于蛋白质绝对定量中母子离子对确证的方法研究

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分析化学 2012年第1期40卷 59-65页

作者：卫军营张养军赵炎陈希曙马岩应万涛钱小红北京理工大学生命学院北京蛋白质组研究中心蛋白质组学国家重点实验室军事医学科学院放射与辐射医学研究所赛默飞世尔科技(中国)有限公司

质谱选择反应监测(SRM)技术在蛋白质绝对定量分析中的应用越来越广泛,其成功应用的关键是肽段母子离子对的正确选择与确证。触发采集二级图谱是目前常用的母子离子对确认方法,但分析效率有待于提高。质谱智能选择反应监测(iSRM)是新近... 详细信息

质谱选择反应监测(SRM)技术在蛋白质绝对定量分析中的应用越来越广泛,其成功应用的关键是肽段母子离子对的正确选择与确证。触发采集二级图谱是目前常用的母子离子对确认方法,但分析效率有待于提高。质谱智能选择反应监测(iSRM)是新近发展的高通量分析方法。为了考察该方法用于通量化母子离子对确证时的效果,选用牛血清白蛋白(BSA)和酵母蛋白提取物作为样品进行分析。结果表明,该方法具有更高的分析灵敏度,可以对低至1 fmol BSA样品中的母子离子对进行确证,而且相对于触发采集二级图谱方法而言,具有更高的分析通量,为规模化母子离子对选择与确证提供了一种新的策略。

关键词：蛋白质绝对定量母子离子对质谱智能选择反应监测

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新型鳞片状聚合物修饰硅胶填料固定化酶的制备及其在蛋白质组鉴定中的应用

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色谱 2012年第6期30卷 549-554页

作者：宋子凤张庆林张养军秦伟捷钱小红广西医科大学广西南宁530021 蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心军事医学科学院放射与辐射医学研究所 102206

利用原子转移自由基聚合法制备了鳞片状聚合物修饰的硅胶填料,将其作为一种新型的固定化酶载体,实现了蛋白酶的高密度固定,从而明显缩短了复杂蛋白质样品的酶解时间。使用标准蛋白质对固定化酶的酶解效率进行了考察,结果表明:鳞片状聚... 详细信息

利用原子转移自由基聚合法制备了鳞片状聚合物修饰的硅胶填料,将其作为一种新型的固定化酶载体,实现了蛋白酶的高密度固定,从而明显缩短了复杂蛋白质样品的酶解时间。使用标准蛋白质对固定化酶的酶解效率进行了考察,结果表明:鳞片状聚合物修饰的新型固定化酶硅胶填料具有较高的酶解效率,酶解标准蛋白质1 min后,鉴定到肽段的氨基酸序列覆盖率可达95%以上。将该固定化酶硅胶填料成功应用于大肠杆菌全蛋白质的酶解,从2 min酶解肽段的混合物中鉴定到的蛋白质数量超过同样条件下溶液酶解12 h的结果。另外,该固定化酶硅胶填料可以重复使用,其酶解效率具有良好的稳定性和重现性;该固定化酶具有较好的样品回收率,因而可以应用于蛋白质组学研究中。

关键词：原子转移自由基聚合反应鳞片状聚合物修饰硅胶制备胰蛋白酶固定蛋白质组学

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二氧化钛富集磷酸肽方法优化及在腾冲嗜热厌氧菌磷酸化蛋白质组分析中的应用

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色谱 2012年第8期30卷 763-769页

作者：林威王京兰应万涛钱小红北京工业大学生命科学与生物工程学院北京100022 蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京102206 蛋白质药物国家工程研究中心北京102206

为了提高二氧化钛富集磷酸肽法对磷酸肽的富集效率,以6种标准蛋白酶切肽段混合物为研究对象,对二氧化钛富集磷酸肽过程中的乙腈比例、三氟乙酸比例、二氧化钛用量等条件分别进行了优化。结果表明在乙腈含量为80%(v/v),三氟乙酸含量为1%(... 详细信息

为了提高二氧化钛富集磷酸肽法对磷酸肽的富集效率,以6种标准蛋白酶切肽段混合物为研究对象,对二氧化钛富集磷酸肽过程中的乙腈比例、三氟乙酸比例、二氧化钛用量等条件分别进行了优化。结果表明在乙腈含量为80%(v/v),三氟乙酸含量为1%(v/v),二氧化钛用量与需要富集肽段的质量比为40∶1的条件下,可以取得较好的富集效果。将优化后的富集方法应用于腾冲嗜热厌氧菌磷酸化蛋白质的分析,初步鉴定到25个磷酸化蛋白质,为进一步研究这种极端环境下生存的低等生物的生命活动提供了参考信息。

关键词：液相色谱质谱二氧化钛磷酸肽富集腾冲嗜热厌氧菌蛋白质组

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免疫质谱法检测肝癌血清多肽标志物

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分析化学 2012年第12期40卷 1803-1806页

作者：傅海媛原剑周晓明孙云波黄亚娟侯利平宋纯艳杨保安甄蓓高蓉貌盼勇林利忠徐淑芳肖汉族魏开华解放军301医院军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京蛋白质组研究中心蛋白质组学国家重点实验室北京正旦国际科技有限责任公司解放军302医院湖南金健药业有限责任公司

建立免疫亲和富集分离与质谱分析相结合的免疫质谱法用于血清多肽标志物pep5的检测。多克隆抗体与蛋白A琼脂糖颗粒偶联用于捕获pep5,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测标志物。本方法的线性范围为1～48 nmol/L,检出限0.2 nmol/L;回... 详细信息

建立免疫亲和富集分离与质谱分析相结合的免疫质谱法用于血清多肽标志物pep5的检测。多克隆抗体与蛋白A琼脂糖颗粒偶联用于捕获pep5,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测标志物。本方法的线性范围为1～48 nmol/L,检出限0.2 nmol/L;回收率为93.0%～103.1%,相对标准偏差(RSD)为6.4%～11.8%;反复冻融3次pep5,检测结果稳定;检测临床肝癌/正常血清样本灵敏度为78.0%、特异度为90%。该方法方便、快速、准确,适用于临床样本中低浓度标志物的检测研究,对于癌症的早期诊断具有重要意义。

关键词：多肽抗体免疫亲和富集质谱

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肝窦内皮细胞生理功能及病理过程的分子机制

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中国生物化学与分子生物学报 2012年第7期28卷 609-616页

作者：劳远翔贺福初姜颖北京工业大学生命科学与生物工程学院北京100022 蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京102206

肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)是肝非实质细胞的主要细胞群,具有物质转运、吞噬、抗原提呈、免疫耐受等功能.肝在遭到多种病原侵袭时,肝窦内皮细胞窗孔逐渐减少或消失,内皮下基膜形成,产生类似于连续型毛细血... 详细信息

肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)是肝非实质细胞的主要细胞群,具有物质转运、吞噬、抗原提呈、免疫耐受等功能.肝在遭到多种病原侵袭时,肝窦内皮细胞窗孔逐渐减少或消失,内皮下基膜形成,产生类似于连续型毛细血管的结构,这一过程称为肝窦毛细血管化.它由多种因素引起,其过程极复杂,在多种肝病的发病前期阶段均有出现,近年来受到广泛关注.而目前关于肝窦内皮细胞的生理功能及病理机制研究方面的系统总结仍少有报道.本文对肝窦内皮细胞的生理功能及肝窦病理机制作一较为全面的综述.除了阐述肝窦毛细血管化自身分子机制的研究进展外,还重点介绍了肝窦毛细血管化参与肝多种疾病发病过程的作用机制.此外,对肝窦内皮细胞相关的研究方法也作了详细的介绍,为全面了解肝窦内皮细胞生理功能及肝窦毛细血管化的分子机理提供参考.

关键词：肝肝窦内皮细胞肝窦毛细血管化发病机制

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表达克隆技术在蛋白质相互作用研究中的应用

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细胞与分子免疫学杂志 2012年第8期28卷 882-884,887页

作者：柳迪唐丽贺福初北京工业大学生命科学与生物工程学院北京100022 蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京102206

相互作用蛋白的发现与研究有助于精确地掌握蛋白质相互作用网络中各个蛋白之间的联系以及这些联系产生的生理功能。表达克隆筛选技术是经典的相互作用蛋白筛选技术之一,其基本原理是选择可能还有目的基因的文库,根据实验需要设计不同的... 详细信息

相互作用蛋白的发现与研究有助于精确地掌握蛋白质相互作用网络中各个蛋白之间的联系以及这些联系产生的生理功能。表达克隆筛选技术是经典的相互作用蛋白筛选技术之一,其基本原理是选择可能还有目的基因的文库,根据实验需要设计不同的筛选方式,经过反复筛选富集目的基因,再通过大规模测序获得目的基因序列。本文着重对报告基因筛选、黏附筛选、血清学筛选等不同筛选方法进行概括总结,为更好地利用这一方法进行相互作用蛋白筛选提供参考。

关键词：表达克隆蛋白质相互作用

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Cbl-b调控T细胞的免疫耐受

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细胞与分子免疫学杂志 2012年第4期28卷 445-447页

作者：张梦瑶孙晓莉唐丽贺福初第四军医大学药学系有机化学教研室陕西西安710032 蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京102206

免疫系统是一个复杂的有机整体,作为调控免疫耐受的分子之一,Cbl-b主要通过诱导T细胞无能与调控性T细胞来负调控免疫作用。本综述旨在阐述Cbl-b负调控免疫作用的具体机制,以及其自身的表达调控机制,以此找到一个新颖且重要的疾病治疗方向。

关键词： Cbl-b 免疫抑制 T细胞无能泛素免疫突触调控性T细胞

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