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用于中和抗体评价和进入抑制剂筛选的多变异株SARS-CoV-2假病毒体系构建与评估

中国免疫学杂志 2024年第4期40卷 811-817页

作者：李静璇刘峰王莹程军平肖智勇周文霞军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

目的:构建一种高滴度SARS-CoV-2假病毒(PsV)体系,用于中和抗体体外评价与病毒进入抑制剂的筛选。方法:共转染慢病毒载体质粒psPAX2、pCDH-Luc与SARS-CoV-2 Spike(S)蛋白表达质粒,收获的假病毒上清感染ACE2-293T细胞。通过测定p24蛋白含... 详细信息

目的:构建一种高滴度SARS-CoV-2假病毒(PsV)体系,用于中和抗体体外评价与病毒进入抑制剂的筛选。方法:共转染慢病毒载体质粒psPAX2、pCDH-Luc与SARS-CoV-2 Spike(S)蛋白表达质粒,收获的假病毒上清感染ACE2-293T细胞。通过测定p24蛋白含量反映PsV滴度,Western blot检测S蛋白在PsV中的表达。利用原始株、D614G、Gamma、Delta、Omicron PsV亚型对1株S蛋白单克隆抗体的中和能力进行评价。采用两种已报道的病毒进入抑制剂氯喹、角叉菜胶检测对Omicron PsV进入的影响。结果:慢病毒载体成功掺入了S蛋白,Western blot结果显示665Y位突变的S蛋白表现出与野生型全长S蛋白(180 kD)不同的切割形式(90 kD)。三质粒体系包装出的PsV滴度更高,S蛋白表达质粒、转移质粒与包装质粒比例在1∶3∶3时为原始株PsV包装的最佳条件。该条件下包装出的5种PsV滴度均在20 ng/ml以上。PsV可有效感染ACE2-293T细胞,双报告基因GFP与萤火虫荧光素酶表达明显,化学发光数值高达106。基于原始株S蛋白的单克隆抗体可有效中和原始株PsV,对原始株PsV的中和作用是对变异株PsV的10~30倍。病毒进入抑制剂氯喹与ι-角叉菜胶可显著抑制Omicron PsV进入宿主细胞。结论:成功构建了高滴度的SARS-CoV-2 PsV进入体系,该体系以荧光素酶报告基因为指示,包含原始株和D614G、PsV Gamma、Delta、Omicron 4种变异株PsV,可有效评价中和抗体与病毒进入抑制剂活性,区分二者对不同变异株的敏感性差异对抗SARS-CoV-2药物研发有重要意义。

关键词： SARS-CoV-2 假病毒 S蛋白中和抗体病毒进入抑制剂

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噻吩诺啡抑制阿片及非阿片类物质诱导的急性抓挠行为

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药学学报 2024年第4期59卷 965-971页

作者：马芳周培岚苏瑞斌南京中医药大学江苏南京210046 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

本文旨在用急性阿片及非阿片类物质建立小鼠瘙痒模型,探究阿片受体部分激动剂噻吩诺啡对致痒物质所致急性瘙痒行为的影响,揭示噻吩诺啡改善急性瘙痒的作用机制。本文用无侵害性小鼠抓挠行为分析系统测试瘙痒行为。C57 BL/6J小鼠分别给... 详细信息

本文旨在用急性阿片及非阿片类物质建立小鼠瘙痒模型,探究阿片受体部分激动剂噻吩诺啡对致痒物质所致急性瘙痒行为的影响,揭示噻吩诺啡改善急性瘙痒的作用机制。本文用无侵害性小鼠抓挠行为分析系统测试瘙痒行为。C57 BL/6J小鼠分别给予吗啡、蛙皮素(鞘内注射,i.t)或五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、氯喹(皮内注射,i.d),建立瘙痒模型,探究噻吩诺啡(0.75、1.5、3 mg·kg^(-1))对致痒物质所致急性瘙痒行为的作用和机制。采用Western blot检测噻吩诺啡对致痒物质诱导的小鼠脊髓段蛋白激酶Cδ(protein kinase Cδ,PKCδ)蛋白表达的影响。实验中所有操作均获得军事医学研究院实验动物伦理委员会批准(批准号:IACUC-2021-017W)。结果显示,吗啡(1 nmol)、蛙皮素(0.3 nmol)、5-HT(5 nmol)、氯喹(20 nmol)分别给药后皆能显著增加小鼠的抓挠行为。噻吩诺啡(1.5 mg·kg^(-1))能够显著抑制阿片类药物吗啡和非阿片类物质蛙皮素、5-HT、氯喹诱导的抓挠行为,并且噻吩诺啡能够明显逆转阿片类药物吗啡和非阿片类致痒物质5-HT诱导的PKCδ蛋白表达的变化。本研究表明,阿片受体部分激动剂噻吩诺啡具有广谱抗瘙痒作用,能够通过不同途径逆转PKCδ而抑制阿片类和非阿片物质诱导的瘙痒行为,为探究和治疗瘙痒提供了新的思路。

关键词：噻吩诺啡瘙痒阿片类非阿片类蛋白激酶C δ 瘙痒治疗

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小鼠两瓶自由选择模型上加波沙朵的精神依赖作用

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中国药理学与毒理学杂志 2024年第2期38卷 97-104页

作者：阿来·木合亚提赵玉俞纲苏瑞斌军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室神经精神药理学北京市重点实验室北京100850

目的利用小鼠两瓶自由选择模型评价突触外γ-氨基丁酸A型受体(GABAAR)激动剂加波沙朵的精神依赖性,并与突触内GABAAR变构调节剂咪达唑仑比较。方法①C57BL/6J雄性小鼠分别ig给予溶剂、咪达唑仑(59.0,73.7,92.2,115.2,144.0和180.0 mg... 详细信息

目的利用小鼠两瓶自由选择模型评价突触外γ-氨基丁酸A型受体(GABAAR)激动剂加波沙朵的精神依赖性,并与突触内GABAAR变构调节剂咪达唑仑比较。方法①C57BL/6J雄性小鼠分别ig给予溶剂、咪达唑仑(59.0,73.7,92.2,115.2,144.0和180.0 mg·kg^(-1))或加波沙朵(8.4,10.5,13.1,16.4,20.5,25.6和32.0 mg·kg^(-1))后进行翻正反射行为观察,通过翻正反射消失量效曲线计算两药的半数有效量(ED50)。②在两瓶自由选择模型上评价加波沙朵或咪达唑仑是否诱导小鼠产生偏好行为。小鼠分为正常对照、加波沙朵或咪达唑仑组。在两瓶自由选择实验的适应期(第1~3天)测试瓶和溶剂对照瓶均装入饮用水,训练期(第4~5天)两瓶均更换为4%蔗糖溶液,测试期(第6~15天)测试瓶分别装入含溶剂、加波沙朵(3.9×10^(-6)mol·L^(-1))或咪达唑仑(1.4×10^(-5)mol·L^(-1))的蔗糖溶液,溶剂对照瓶分别装入含相应溶剂的蔗糖溶液,置于饲养笼两侧。小鼠自由选择两瓶饮用,分别记录测试瓶和溶剂对照瓶每日饮用量,计算每日总饮用量、测试期内药液累计饮用量、相对饮用量和测试期内累计相对饮用量,并每日记录小鼠体重。结果①咪达唑仑和加波沙朵均剂量依赖性地增加小鼠翻正反射消失率,ED50分别为咪达唑仑105.3 mg·kg^(-1)(95%Cl:96.4~115.2 mg·kg^(-1),R^(2)=0.9796)、加波沙朵13.7 mg·kg^(-1)(95%Cl:12.6~15.0 mg·kg^(-1),R^(2)=0.9773)。②与正常对照组相比,加波沙朵组和咪达唑仑组每日总饮用量无显著变化;咪达唑仑组在测试期第11~15天测试瓶每日饮用量较同组溶剂对照瓶显著增加(P<0.05),测试期内加波沙朵组测试瓶每日饮用量也显著升高(P<0.01)。与正常对照组比较,咪达唑仑组和加波沙朵组测试瓶累计饮用量无统计学差异;加波沙朵组第9天的每日相对饮用量显著增加(P<0.05),测试期累计相对饮用量也显著增高(P<0.01)。各组小鼠体重变化无显著性差异。结论在两瓶自由选择模型上,咪达唑仑和加波沙朵均诱导小鼠产生饮用偏好,提示加波沙朵可能也存在精神依赖潜能。

关键词：咪达唑仑加波沙朵两瓶自由选择模型翻正反射消失精神依赖

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DNA聚合酶θ:易错的多功能DNA末端修复分子

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生物化学与生物物理进展 2024年第3期51卷 493-503页

作者：王瑶陈国江冯健男石艳春王晶郑源强内蒙古医科大学内蒙古自治区分子生物学重点实验室呼和浩特010058 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

DNA聚合酶θ(DNA polymerase theta,Polθ)是一种广泛存在于动植物中的DNA修复酶。它在选择性末端连接(alternative end-joining,Alt-EJ)途径中发挥着关键作用,常参与DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSB)损伤修复。在正常生理状态下,Polθ主要调控基因组稳定性。然而,在恶性肿瘤发生时,Polθ表现出异常高表达水平,并参与调控肿瘤细胞的恶性转变过程。研究表明,抑制Polθ活性可导致同源重组(homologous recombination,HR)缺陷的肿瘤细胞发生合成致死(synthetic lethality,SL)。因此,已经开发出多种针对Polθ的小分子抑制剂,可与其他化疗药物联合使用以抑制恶性肿瘤的发展。此外,敲除或抑制Polθ活性还能增加HR修复效率,从而提高外源基因靶向整合效果。本文综述了Polθ及其介导的Alt-EJ修复机制在生物学功能方面的最新研究进展,为靶向Polθ在肿瘤治疗和基因编辑方面的应用提供理论基础。

关键词： DNA聚合酶θ DNA双链断裂修复基因组稳定性肿瘤抑制靶向整合

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蛋白修饰定量质谱法研究两种不同作用模式基因毒化合物对组蛋白H3乙酰化的影响

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分析化学 2022年第6期50卷 940-947页

作者：瞿敏敏陈佳徐斌李治郭磊徐华谢剑炜军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室

建立了细胞中组蛋白H3的9位（H3K9ac）或14位（H3K14ac）赖氨酸乙酰化及其相应原型特征多肽片段的高效液相色谱-三重四极杆质谱同时定量分析方法。样品经胰酶消化、丙酰化衍生、除盐及肽段富集等前处理后，在ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱... 详细信息

建立了细胞中组蛋白H3的9位（H3K9ac）或14位（H3K14ac）赖氨酸乙酰化及其相应原型特征多肽片段的高效液相色谱-三重四极杆质谱同时定量分析方法。样品经胰酶消化、丙酰化衍生、除盐及肽段富集等前处理后，在ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱上分离，采用质谱技术在正离子多反应监测模式（MRM）下检测。空白细胞样品中组蛋白H3的各特征肽段在1～250 ng/mL浓度范围内线性关系良好（R2> 0.99），检出限（LOD,S/N=3）均为0.1 ng/mL，准确度、精密度、基质效应及提取回收率均符合方法学要求。本方法具有操作简便、灵敏度高、检测速度快及定量分析准确等优势。将本方法应用于2种典型的不同作用模式的基因毒性化合物（喜树碱和秋水仙碱）对2种人源细胞株即肝癌细胞HepG2和宫颈癌细胞HeLa中组蛋白H3的9位或14位赖氨酸乙酰化修饰影响的研究，测得了组蛋白H3中H3K9ac及H3K14ac修饰含量的变化，探讨了其与不同基因毒性化合物作用模式的关系，为基因毒性化合物的DNA损伤/修复及转录研究提供了技术支持。

关键词：高效液相色谱质谱组蛋白H3 乙酰化基因毒性化合物

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关于5-HT 2A受体关键氨基酸位点的研究进展

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中国药理学通报 2024年第11期40卷 2001-2004页

作者：谢璐璐刘晓倩苏瑞斌李玉婷谭博沈阳药科大学无涯创新学院辽宁沈阳110016 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

5-HT 2A受体作为许多精神活性药物如致幻剂、抗抑郁药、抗焦虑药和非典型抗精神病药等的作用靶点,一直是神经精神药理学领域研究热点。5-HT 2A受体的某些关键氨基酸位点对于维持受体的特定构象、偶联不同G蛋白以及行使相应特定功能等起... 详细信息

5-HT 2A受体作为许多精神活性药物如致幻剂、抗抑郁药、抗焦虑药和非典型抗精神病药等的作用靶点,一直是神经精神药理学领域研究热点。5-HT 2A受体的某些关键氨基酸位点对于维持受体的特定构象、偶联不同G蛋白以及行使相应特定功能等起重要作用。进一步的研究显示,突变这些特定的氨基酸位点,能够引起相应配体的亲和力、效能等变化。同时,5-HT 2A受体作为一种典型的G蛋白偶联受体,其结构域中不同的氨基酸位点能与不同配体产生相互作用,引起受体相应的动态结构变化,从而影响受体的功能。因此,研究5-HT 2A受体结构和功能与关键氨基酸位点的关系,对于相关精神疾病的治疗以及设计高效低毒的新型药物具有重要意义。

关键词： 5-HT 2A受体 G蛋白偶联受体氨基酸位点相互作用分子对接分子机制

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芥子气三肽加合物合成新路线开发及在确证分析中的应用

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分析化学 2022年第1期50卷 136-146页

作者：杨展刘玉龙陈佳吴剑峰何跃忠谢剑炜军事科学院军事医学研究院军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室

芥子气(Sulfur mustard, SM)是一种典型的难防难治化学战剂，生物体SM暴露后，除自身发生氧化水解代谢反应外，还会与体内的蛋白质、谷胱甘肽及DNA等生成一系列的加合物。白蛋白在血浆中丰度较高，芥子气与其34位半胱氨酸(Cys-34)结合... 详细信息

芥子气(Sulfur mustard, SM)是一种典型的难防难治化学战剂，生物体SM暴露后，除自身发生氧化水解代谢反应外，还会与体内的蛋白质、谷胱甘肽及DNA等生成一系列的加合物。白蛋白在血浆中丰度较高，芥子气与其34位半胱氨酸(Cys-34)结合形成加合物，再经蛋白酶K水解后生成三肽加合物(HETE-Cys-Pro-Phe, HETE-CPF)。HETE-CPF半衰期长、稳定性好，是溯源SM暴露最有效，也是最重要的生物标志物。本研究以易获取的商品化试剂氯乙醇为起始原料，开发了一条新的HETE-CPF合成方法。相比于原有以2-氯乙基巯基乙醇为起始原料的合成方法，新方法副反应更少、纯化更简便。在此基础上建立了可用于全血样本中HETE-CPF的高灵敏分析检测方法，检测灵敏度可达2 ng/mL。同时，还鉴定出大鼠经尾静脉注射SM暴露后，其与血浆白蛋白形成的暴露标志物与人源血浆差异显著，为HETE-Cys-Pro-Tyr(HETE-CPY),并非HETE-CPF,两者白蛋白一级序列差异是导致标志物不同的根本原因。

关键词：芥子气固相肽合成白蛋白加合物高分辨质谱

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蛋白质磷酸化修饰参与经典致幻剂诱导的大鼠甩头反应

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中国药理学通报 2023年第10期39卷 1899-1904页

作者：王劭文周亚男孙毅苏瑞斌南京中医药大学江苏南京210000 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

目的探究经典致幻剂通过蛋白质翻译后修饰(protein post-translational modifications,PTMs)调控急性甩头反应机制。方法大鼠单次腹腔注射经典致幻剂LSD、DOM和Psilocin进行甩头反应实验,选取甩头次数最高的剂量建立甩头反应动物模型;We... 详细信息

目的探究经典致幻剂通过蛋白质翻译后修饰(protein post-translational modifications,PTMs)调控急性甩头反应机制。方法大鼠单次腹腔注射经典致幻剂LSD、DOM和Psilocin进行甩头反应实验,选取甩头次数最高的剂量建立甩头反应动物模型;Western blot检测经典致幻剂给药10和30 min后大鼠前额叶皮层中蛋白质的磷酸化、乙酰化、泛素化修饰变化情况。结果LSD(0.025 mg·kg^(-1),i.p.)、DOM(3 mg·kg^(-1),i.p.)、Psilocin(8 mg·kg^(-1),i.p.)为大鼠甩头反应动物模型最佳剂量;经典致幻剂给药10 min和30 min后大鼠前额叶皮层中蛋白质磷酸化变化明显。结论蛋白质磷酸化修饰参与经典致幻剂诱导的大鼠甩头反应。

关键词：经典致幻剂动物模型甩头反应前额叶皮层蛋白质翻译后修饰磷酸化乙酰化泛素化

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纳米材料在激光解吸电离质谱技术中的应用进展

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分析化学 2023年第2期51卷 172-187页

作者：王闯覃露媛李冬梅薛晋娟郭磊唐丽中央民族大学药学院民族医药教育部重点实验室军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室

近年来，基于纳米材料的激光解吸/电离质谱（LDI-MS）技术发展迅速。由于纳米材料具有激光吸收能量转移效率高、比表面积大、易功能化修饰、自身不易电离等特性，因此，LDI-MS技术具备灵敏、快速、高通量和谱图背景相对纯净等优点。本... 详细信息

近年来，基于纳米材料的激光解吸/电离质谱（LDI-MS）技术发展迅速。由于纳米材料具有激光吸收能量转移效率高、比表面积大、易功能化修饰、自身不易电离等特性，因此，LDI-MS技术具备灵敏、快速、高通量和谱图背景相对纯净等优点。本文针对近十年来基于碳基纳米材料、硅基纳米材料、金属有机框架、共价有机框架、金属基纳米材料等的LDI-MS在生物医学分析中的检测应用现状进行了分类和简要评述，并基于分析物种类和灵敏度等因素，比较了各类纳米材料的多种改性或复合途径的影响，聚焦于内外源代谢物空间分布的适用性，简要论述了各类纳米材料在质谱成像中的应用进展，最后阐述了该领域的重点、难点问题以及发展前景。

关键词：激光解吸电离质谱基质纳米材料生物医学样品质谱成像评述

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微RNA在甲基苯丙胺成瘾中的作用研究进展

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中国药理学与毒理学杂志 2023年第8期37卷 609-620页

作者：卢关伊吴宁李锦军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室神经精神药理学北京市重点实验室北京100850

甲基苯丙胺(MA)成瘾是严重的医学和社会问题,其机制尚未完全阐明,临床上缺乏有效的诊断和治疗方法。近年来,越来越多的研究表明,微RNA(miRNA)在MA成瘾中发挥重要调节作用。非临床研究表明,miRNA可能通过调节神经可塑性、神经系统和免疫... 详细信息

甲基苯丙胺(MA)成瘾是严重的医学和社会问题,其机制尚未完全阐明,临床上缺乏有效的诊断和治疗方法。近年来,越来越多的研究表明,微RNA(miRNA)在MA成瘾中发挥重要调节作用。非临床研究表明,miRNA可能通过调节神经可塑性、神经系统和免疫系统损伤,参与MA成瘾的发生和发展。临床研究表明,miRNA作为潜在的生物标志物在MA成瘾的诊断方面具有较好的应用前景。近期,研究人员开始关注细胞外囊泡中的miRNA在MA成瘾中的作用,其在MA成瘾的诊断和研究中枢与外周相互作用机制方面具有更大的应用前景。本文对miRNA在MA成瘾中的调节作用及机制及诊断和治疗等方面的研究进展进行全面系统综述,旨在阐明MA成瘾的神经生物学机制,为其诊断和治疗研究提供新思路。

关键词：甲基苯丙胺成瘾微RNA 生物标志物细胞外囊泡

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