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第12届全国实验血液学会议

作者：周军年李思霆谢一帆陈海旭贺文艳施双双南雪岳文刘兵裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室

目的:在小鼠胚胎发育过程中,造血位点的研究是造血细胞发生学上一个热点和难点,主要是由于8.5dpc时血液循环的建立给此后的精确研究带来了困难,目前在转基因小鼠中得到的研究结果越来越倾向于主动脉-性腺-中肾(AGM区)和卵黄囊(YS)都可... 详细信息

目的:在小鼠胚胎发育过程中,造血位点的研究是造血细胞发生学上一个热点和难点,主要是由于8.5dpc时血液循环的建立给此后的精确研究带来了困难,目前在转基因小鼠中得到的研究结果越来越倾向于主动脉-性腺-中肾(AGM区)和卵黄囊(YS)都可能是独立的造血发生位点。我们试图建立一个简化的造血发生评价模型来评估不

关键词：克隆形成能力循环血

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诱导脐带血来源的CD34+细胞重编程获得诱导性多能干细胞(iPS cells)

诱导脐带血来源的CD34+细胞重编程获得诱导性多能干细胞(iPS cell...

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第12届全国实验血液学会议

作者：姚海雷张文成王思涵李保伟张锐习佳飞周军年吕洋曾泉施双双何丽娟南雪李艳华岳文裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室

目的:目前已经利用转录因子的表达使得人类各种成体细胞(表皮成纤维细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肝细胞、外周血细胞等)重编程形成诱导性多能干细胞(iPS cells),然而对脐带血来源的细胞的诱导仍在研究

关键词：多能干细胞 iPS cells 多潜能性细胞重编程

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Wnt3a提高CD34+造血干/祖细胞红系分化潜能机制的初步研究

Wnt3a提高CD34+造血干/祖细胞红系分化潜能机制的初步研究

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第12届全国实验血液学会议

作者：师伟任祥亮李艳华吕洋施双双陈琳南雪岳文裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室

目的:Wnt信号通路在造血干/祖细胞增殖分化过程中发挥至关重要的作用。我们在前期研究中发现Wnt3a具有提高CD34+造血干/祖细胞红系分化潜能的作用,在此实验基础上,我们对对Wnt3a提高CD34+造血干/祖细胞红系分化潜能机制进行了一些初步... 详细信息

目的:Wnt信号通路在造血干/祖细胞增殖分化过程中发挥至关重要的作用。我们在前期研究中发现Wnt3a具有提高CD34+造血干/祖细胞红系分化潜能的作用,在此实验基础上,我们对对Wnt3a提高CD34+造血干/祖细胞红系分化潜能机制进行了一些初步的研究。

关键词：干/祖细胞红系分化 Wnt3a 初步研究

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人羊水来源MSC的分离培养鉴定及其免疫抑制特性的初步研究

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军事医学科学院院刊 2009年第2期33卷 109-112页

作者：胡洁杨丽娟刘慧王韫芳岳文魏林王润田裴雪涛河北医科大学基础医学研究所免疫室石家庄050017 军事医学科学院野战输血研究所干细胞与再生医学研究室北京100850 河北医科大学基础医学院免疫教研室石家庄050017 中国人民解放军总医院妇产科北京100853

目的:体外分离培养鉴定具有间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)特征的人羊水来源细胞,并对其免疫抑制特性进行初步评价。方法:贴壁法体外分离培养人羊水来源细胞,多次传代扩增后,采用形态学观察、流式细胞术分析表型以及定向诱导... 详细信息

目的:体外分离培养鉴定具有间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)特征的人羊水来源细胞,并对其免疫抑制特性进行初步评价。方法:贴壁法体外分离培养人羊水来源细胞,多次传代扩增后,采用形态学观察、流式细胞术分析表型以及定向诱导分化为脂肪样细胞、成骨样细胞等方法进行鉴定后,以细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)体外检测人羊水来源间充质干细胞(amniotic fluid derived-mesenchymal stem cells,AFMSC)对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,并对其时效、量效关系进行分析。结果:具备MSC形态、表型及分化潜能特征的人羊水来源细胞,可于体外显著抑制ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖(P<0.05),时效、量效关系显著(P<0.05)。结论:从免疫抑制特性角度证明羊水可成为替代骨髓的MSC新来源。

关键词：羊水间质干细胞免疫抑制

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肝细胞条件培养液对人脂肪间充质干细胞向肝细胞分化和增殖的作用

肝细胞条件培养液对人脂肪间充质干细胞向肝细胞分化和增殖的作用

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难治性丙型肝炎的治疗研讨会

作者：王敏裴海云管利东南雪白慈贤刘慧李保伟王韫芳裴雪涛 100850 北京军事医学科学院输血氏学研究所干细胞与再生医学研究室解放军总医院

目的：探讨人脂肪间充质干细胞在改良的诱导体系下向肝细胞的分化和增殖情况,为肝组织工程提供新的种子细胞来源. 方法：从人脂肪组织分离出脂肪间充质干细胞,用含有碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4... 详细信息

目的：探讨人脂肪间充质干细胞在改良的诱导体系下向肝细胞的分化和增殖情况,为肝组织工程提供新的种子细胞来源. 方法：从人脂肪组织分离出脂肪间充质干细胞,用含有碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4的肝细胞诱导液进行诱导,并于诱导7 d后加入抑瘤素M.用细胞计数试剂盒-8法检测整个诱导过程细胞的增殖情况;通过光学显微镜观察诱导细胞的形态变化;用RT-PCR法和免疫荧光法分别检测肝细胞特异性基因和蛋白的表达;并对多种肝细胞特异性功能进行检测.组间比较采用t-test检验. 结果：用改良肝细胞诱导液培养的人脂肪间充质干细胞在培养第5、7、14、21天时,细胞数均明显多于用对照培养液培养的细胞(f值分别为6.59、8.69、15.94和24.64,P值均＜0.05).诱导细胞表现出上皮样肝细胞形态,表达肝细胞特异性基因和蛋白;具有多种肝细胞特异性功能,如靛青绿摄取/排泌、糖原合成以及白蛋白分泌功能. 结论：人脂肪间充质干细胞在含碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4和抑瘤索M的诱导体系中能够分化为更加成熟的具有多种肝细胞特异性功能的细胞,且此诱导体系同时具有促进细胞增殖的作用。

关键词：干细胞细胞分化肝细胞增殖肝组织工程种子细胞成纤维细胞生长因子免疫荧光法

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胰蛋白酶差速脱壁法分离纯化人表皮干细胞

胰蛋白酶差速脱壁法分离纯化人表皮干细胞

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2009年度宋儒耀整形外科青年医师论坛

作者：闫迎军刘大庆何丽娟管利东施双双乔群裴雪涛煤炭总医院整形外科军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室北京协和医院整形外科

表皮干细胞对于修复皮肤缺损具有重要意义，但如何方便、快捷地对所获取的表皮干细胞进行纯化培养一直没有比较好的技术方法。目的：拟应用胰蛋白酶差速脱壁法去除表皮干细胞中混杂的成纤维细胞。设计、时间及地点：细胞学体外观察... 详细信息

表皮干细胞对于修复皮肤缺损具有重要意义，但如何方便、快捷地对所获取的表皮干细胞进行纯化培养一直没有比较好的技术方法。目的：拟应用胰蛋白酶差速脱壁法去除表皮干细胞中混杂的成纤维细胞。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006-06/2007-06在解放军军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室完成。材料：实验所用皮肤来源于20~30岁女性乳房缩小整形术患者，由北京协和医院整形外科提供。方法：无菌条件下切取皮肤，剪除皮下脂肪组织，采用胶原酶/Dispase酶和胰蛋白酶两步法体外分离培养表皮干细胞。待细胞生长达70[％]～80[％]融合时，加入胰蛋白酶消化尚未脱壁的细胞，30s1min后吸出脱壁细胞，同法传代培养至第5代细胞。主要观察指标：第1，5代表皮干细胞表面标志CD29、CD49f、CD71的表达。流式细胞仪检测第5代细胞生长周期。免疫荧光检测第5代表皮干细胞和传代时胰蛋白酶消化30s~1min即脱壁细胞角蛋白19及波形蛋白的表达。透射电镜观察表皮干细胞超微结构。结果：第1代表皮干细胞CD29阳性率94.32[％]，CD49f阳性率86.24[％]，CD71呈弱阳性，经过4次胰蛋白酶差速脱壁去除混杂细胞后，第5代表皮干细胞CD29阳性率96.77[％]，CD49f阳性率96.31，CD71呈弱阳性，82.58[％]表皮干细胞处于G0~G1期。第5代表皮干细胞角蛋白19呈阳性，波形蛋白呈阴性，而传代时胰蛋白酶消化脱壁的细胞角蛋白19呈阴性，波形蛋白呈阳性，证实为成纤维细胞。表皮干细胞呈克隆样生长，透射电镜下胞质中可见呈束状排列的角蛋白丝。结论：应用胰蛋白酶差速脱壁法能够简单、有效地获取纯化的表皮干细胞。

关键词：表皮干细胞分离纯化胰蛋白酶差速脱壁法皮肤缺损

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NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测

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生物化学与生物物理进展 2008年第2期35卷 151-158页

作者：杨印祥李艳华刘庆斌张赛男陈琳吕洋白慈贤南雪裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况.构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体.通过RNAi序列设... 详细信息

为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况.构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体.通过RNAi序列设计软件进行NRSF干涉片段及脱靶对照片段的设计,然后构建慢病毒干涉载体.包装产生慢病毒干涉毒液,用其感染HeLa细胞获得稳定干涉NRSF的细胞株,利用RT-PCR、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色等方法检测NRSF的干涉效果及其下游基因的表达情况,观察干涉NRSF后胰岛素启动子报告载体荧光素酶活性的变化.构建具有NRSF干涉效果的慢病毒干涉载体成功,并获得了稳定干涉NRSF及脱靶对照的HeLa细胞株,RT-PCR及实时定量PCR检测结果表明,NRSF干涉片段的干涉效率为56%(n=6,P<0.01),蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色方法检测证实干涉后NRSF蛋白表达水平明显降低.RT-PCR实验表明干涉NRSF后下游基因开始表达,荧光素酶活性分析表明,干涉NRSF后胰岛素启动子活性增强了2.4倍(n=3,P<0.01).上述结果表明,成功构建NRSF的慢病毒干涉载体并获得稳定干涉NRSF的HeLa细胞株,干涉NRSF后,其下游基因特别是胰岛素基因开始表达.这一研究工作有助于我们进一步了解NRSF在胰岛细胞发育分化中的调控作用.

关键词：神经元限制性沉默因子神经元限制性沉默元件 RNA干涉胰岛素

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siRNA沉默socs3对红系发育的影响

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生物化学与生物物理进展 2008年第7期35卷 778-784页

作者：刘雨潇吉蕾袁红丰陈琳薛郡管兆轩南雪白慈贤王韫芳岳文裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

为了研究细胞因子信号转导分子3(suppressor of cytokine signals-3,SOCS-3)对造血发育的影响,构建了SOCS-3慢病毒siRNA干涉载体,并转染人红白血病细胞株K562.根据绿色荧光蛋白的表达进行流式分选后,获得了高表达慢病毒干涉载体的细胞.... 详细信息

为了研究细胞因子信号转导分子3(suppressor of cytokine signals-3,SOCS-3)对造血发育的影响,构建了SOCS-3慢病毒siRNA干涉载体,并转染人红白血病细胞株K562.根据绿色荧光蛋白的表达进行流式分选后,获得了高表达慢病毒干涉载体的细胞.实时荧光定量PCR和Western-blot检测了转染细胞中SOCS-3基因的干涉效率,结果显示,与对照组相比,siRNA干涉后K562细胞SOCS-3基因的表达量仅为其相对表达量的22.1%,干涉效率77.9%;Western-blot结果显示,SOCS-3在蛋白质水平表达也明显受抑制.进一步对SOCS-3基因沉默后的K562细胞进行了诱导分化,并采用联苯胺染色法检测K562细胞向红系分化比例变化,免疫荧光染色检测细胞表面抗原的变化,RT-PCR检测造血相关基因的变化.结果发现,SOCS-3沉默后K562细胞向红系的发育能力显著提高.研究结果证明,SOCS-3在造血发育中有重要调控作用,而对其表达进行干涉或沉默将在规模化的红细胞诱导研究中发挥重要作用.

关键词： siRNA 基因沉默 SOCS-3 慢病毒 K562细胞

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用慢病毒转染RNAi技术沉默胆固醇7α羟化酶的基因表达,降低肝细胞中胆汁酸的分泌

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生物物理学报 2008年第3期24卷 182-190页

作者：郑吉春裴海云杨印祥姚海雷罗海英王婧陈琳南雪白慈贤王韫芳岳文裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

为了降低生物人工肝(bioartificial liver system)中肝细胞胆汁酸的分泌,构建了胆固醇7α羟化酶慢病毒RNA干涉载体,并转染人肝脏细胞(L-02)。根据绿色荧光蛋白的表达评估转染效率后进行流式分选,获得高表达慢病毒干涉载体的细胞,并以野... 详细信息

为了降低生物人工肝(bioartificial liver system)中肝细胞胆汁酸的分泌,构建了胆固醇7α羟化酶慢病毒RNA干涉载体,并转染人肝脏细胞(L-02)。根据绿色荧光蛋白的表达评估转染效率后进行流式分选,获得高表达慢病毒干涉载体的细胞,并以野生型L-02细胞和仅转染pSicoR空载体的L-02细胞作对照,观察肝细胞胆固醇7α羟化酶的表达以及培养上清中总胆汁酸含量。利用半定量PCR、实时荧光定量PCR及Western-blot等实验方法检测了转染细胞中基因的干涉效果,结果显示:与对照组相比,在mRNA水平,转染慢病毒siRNA载体的L-02细胞,其胆固醇7α羟化酶基因的表达量仅为野生型L-02细胞表达量的31.2%,为转染pSicoR空载体的L-02细胞的34.1%,干涉效率分别为68.8%和65.9%,均具有显著差异(P<0.05);Western-blot结果显示胆固醇7α羟化酶在蛋白质水平表达也明显受到抑制,表明转染慢病毒siRNA下调了肝细胞中胆固醇7α羟化酶基因的表达,减少了胆汁酸的分泌。以上研究结果表明,利用RNAi技术可以获得低表达胆固醇7α羟化酶基因的肝细胞,并有效降低肝细胞中胆汁酸的分泌,为临床上生物人工肝的构建及应用奠定基础。

关键词：胆固醇7α羟化酶 RNAi 慢病毒肝细胞胆汁酸

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CTLA4基因修饰骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化及其免疫抑制功能研究

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生物化学与生物物理进展 2008年第9期35卷 1021-1030页

作者：罗海英王韫芳翟树森张玉君南雪白慈贤施双双尉承泽岳文孔维裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室北京100850 解放军307医院普外科北京100071 第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所重庆400038 吉林大学生命科学学院长春130012

用携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs),体外向肝细胞诱导分化,并检测其免疫抑制功能.用含有HGF等细胞因子培养液诱导重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染大鼠BMMSCs向肝细胞分化.... 详细信息

用携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs),体外向肝细胞诱导分化,并检测其免疫抑制功能.用含有HGF等细胞因子培养液诱导重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染大鼠BMMSCs向肝细胞分化.诱导后的细胞可表达AFP、Alb和CK18等肝细胞标志,同时还具有储存糖原和摄取、排泌靛青绿等肝细胞功能.转基因BMMSCs在未经诱导和诱导后均可表达CTLA4Ig,诱导14天时表达量有所减弱.单向混合淋巴细胞反应证实,诱导7天的转基因BMMSCs具有明显的抑制淋巴细胞反应的作用,其抑制作用明显高于未转基因BMMSCs,且CTLA4Ig基因修饰BMMSCs输注还可以明显延长肝移植大鼠的存活时间.用重组腺病毒Ad-CTLA4Ig对BMMSCs进行基因修饰,一方面不会影响BMMSCs的肝细胞分化潜能,另一方面使BMMSCs的免疫抑制特性得到进一步强化.

关键词：间充质干细胞 CTLA4Ig 腺病毒分化免疫抑制

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