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第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：叶小丽吕茂民颜奇坡吴健敏田克恭马玉媛章金刚军事医学科学院野战输血研究所国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室广西兽医研究所中国动物疫病预防控制中心

目的猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)是猪-人异种移植及猪源血液代用品的研发中备受关注的病毒。PERV存在跨种传播感染人源细胞的风险,但是目前对它的宿主范围和细胞嗜性并不明确,而且PERV难以体外操作也阻碍... 详细信息

目的猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)是猪-人异种移植及猪源血液代用品的研发中备受关注的病毒。PERV存在跨种传播感染人源细胞的风险,但是目前对它的宿主范围和细胞嗜性并不明确,而且PERV难以体外操作也阻碍了这一方面的相关研究。本研究旨在包装带有绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Prontein,GFP)标签的PERV囊膜化的假型鼠干细胞病毒,为研究PERV的宿主细胞嗜性范围奠定基础。方法向鼠干细胞病毒载体(MSCV)内插入GFP报告基因,并经菌落PCR、酶切及测序鉴定;将真核表达质粒pHCMV-env、反转录病毒载体MSCVneo-GFP和辅助质粒pGag-Pol三质粒共转染HEK293T细胞包装病毒,72h后收集转染细胞培养上清,低温超速离心浓缩上清液后直接感染HEK293T细胞,对病毒的感染性进行检测,并利用流式细胞仪对病毒滴度进行监测。结果成功将GFP插入反转录病毒载体;包装病毒感染HEK293T细胞结果表明,假型病毒粒子包装成功并且具有感染性,流式分析检测病毒粒子滴度为1.4×10～3(cfu/ml)。结论包装得到的表达GFP的整合猪内源性反转录病毒的假型鼠干细胞病毒粒子具有有效的感染性;该研究结果为深入研究PERV的宿主范围和细胞嗜性及PERV与感染细胞的相互作用提供了安全、有效的技术支持。

关键词： GFP PERV env基因反转录病毒载体MSCV 假型病毒

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利用生物条形码技术对蓝舌病毒VP7蛋白进行微量检测

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生物技术通讯 2008年第5期19卷 697-700页

作者：张立营张红杨姝吕茂民尹惠琼张改平李德雪章金刚军事医学科学院野战输血研究所国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室北京100850 河南农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002

目的:建立高灵敏检测蓝舌病毒VP7蛋白的生物条形码检测方法。方法:制备VP7蛋白的多抗及特异DNA链标记的金纳米颗粒探针(NP)和VP7蛋白单抗标记的磁性微球探针(MMP),形成MMP-VP7蛋白-NP三明治复合物后,再利用去杂交将NP探针上标记的DNA链... 详细信息

目的:建立高灵敏检测蓝舌病毒VP7蛋白的生物条形码检测方法。方法:制备VP7蛋白的多抗及特异DNA链标记的金纳米颗粒探针(NP)和VP7蛋白单抗标记的磁性微球探针(MMP),形成MMP-VP7蛋白-NP三明治复合物后,再利用去杂交将NP探针上标记的DNA链释放出来,通过PCR或芯片检测方法鉴定释放的DNA链,确定VP7蛋白的存在。结果:建立了蓝舌病毒VP7蛋白的生物条形码检测体系,检测灵敏度可达10fg/mL,为常规ELISA检测的106倍。结论:为发展高灵敏度的蓝舌病毒生物条形码检测试剂盒鉴定了基础。

关键词：蓝舌病毒生物条形码检测 VP7蛋白

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嗜人性PERV感染性克隆感染人源细胞后Stathmin蛋白表达差异分析

嗜人性PERV感染性克隆感染人源细胞后Stathmin蛋白表达差异分析

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：颜奇坡马玉媛吕茂民叶小丽郑霖吴健敏田克恭章金刚国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室军事医学科学院野战输血研究所农业部兽医诊断中心广西壮族自治区兽医研究所

猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retroviruses,PERV)是猪→人异种移植中倍受关注的病毒。PERV感染人源细胞后虽然没有细胞病变,但这种隐性感染是否会通过潜在的与宿主细胞相互作用引起肿瘤或者癌变,其感染后的潜在生理和病理效... 详细信息

猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retroviruses,PERV)是猪→人异种移植中倍受关注的病毒。PERV感染人源细胞后虽然没有细胞病变,但这种隐性感染是否会通过潜在的与宿主细胞相互作用引起肿瘤或者癌变,其感染后的潜在生理和病理效应仍有待研究。本研究旨在分析嗜人性PERV感染的人源细胞中

关键词：感染性克隆 Stathmin 差异分析

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ELISPOT技术在人类新发传染病疫苗研究中的应用

ELISPOT技术在人类新发传染病疫苗研究中的应用

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第四届全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：郑霖马玉媛田克恭章金刚国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室军事医学科学院野战输血研究所北京100850 中国动物疫病预防控制中心北京100094

新发传染病(EID)是指在过去20年中发病率增加或在不久的将来可能增加的人类传染病，包含“回潮”的老传染病和新出现的传染病。本文从原理、具体实验操作、技术优势和在新发传染病疫苗研究中的应用等几方面对ELISPOT技术进行了介绍。

关键词：新发传染病免疫血清学酶联免疫斑点法

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猪内源性反转录病毒囊膜基因env真核表达质粒的构建及鉴定

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生物技术通讯 2011年第5期22卷 683-686页

作者：叶小丽吕茂民颜奇坡郭逸吴健敏田克恭马玉媛章金刚军事医学科学院野战输血研究所国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室北京100850 广西兽医研究所广西南宁530001 中国动物疫病预防控制中心北京100094

目的:构建猪内源性反转录病毒(PERV)囊膜基因env的真核表达质粒pHCMV-env并加以鉴定,为研究PERV的细胞嗜性和宿主范围奠定基础。方法:用RT-PCR方法扩增五指山猪来源PERV的env基因,将其插入pGEM-T easy载体中,构建重组质粒pGEM-T-env,酶... 详细信息

目的:构建猪内源性反转录病毒(PERV)囊膜基因env的真核表达质粒pHCMV-env并加以鉴定,为研究PERV的细胞嗜性和宿主范围奠定基础。方法:用RT-PCR方法扩增五指山猪来源PERV的env基因,将其插入pGEM-T easy载体中,构建重组质粒pGEM-T-env,酶切鉴定正确后,将pGEM-T-env与pHCMV-VSV-G表达质粒同时经EcoRⅠ酶切消化后连接,构建重组表达质粒pHCMV-env,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的质粒pHCMV-env转染HEK293T细胞,采用PCR、RT-PCR检测转染后env基因的整合和转录情况。结果:扩增得到五指山猪来源PERV的env基因,并构建了pHCMV-env真核表达质粒,转染HEK293T细胞系后,该细胞系中有目的基因的整合和转录。结论:构建了真核表达质粒pHCMV-env,并且在HEK293T细胞中能够整合并转录,为研究PERV的细胞嗜性和宿主范围奠定了基础。

关键词：猪内源性反转录病毒 env基因真核表达

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蓝舌病病毒实时荧光RT-PCR检测技术

蓝舌病病毒实时荧光RT-PCR检测技术

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2012第四届中国兽药大会

作者：尹惠琼张红史利军杨姝张改平王升启章金刚国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室，军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850 河南省农业科学院，郑州 450002 军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850

全球共分离到24个蓝舌病病毒血清型，建立各血清型蓝舌病病毒的通用检测技术对控制蓝舌病极其重要。本研究建立了用于不同血清型蓝舌病病毒NSI基因检测的实时荧光RT—PCR／TaqMan检测技术。这一检测技术可有效检出蓝舌病病毒1-22型，与... 详细信息

全球共分离到24个蓝舌病病毒血清型，建立各血清型蓝舌病病毒的通用检测技术对控制蓝舌病极其重要。本研究建立了用于不同血清型蓝舌病病毒NSI基因检测的实时荧光RT—PCR／TaqMan检测技术。这一检测技术可有效检出蓝舌病病毒1-22型，与亲缘关系最近的鹿流行性出血热病毒无交叉反应。检测灵敏度为0.1 TCID50／ml BTV-1、102拷贝阳性对照品(R121／pGEM).在102-106copies阳性对照品(R121／pGEM)具有良好的线性关系。批内和批间重复系数为2.17—5.60%，对122份绵羊全血样品进行检测，与双重RT—PCR具有良好的符合率(99.2％)。因此，这一方法可用于不同血清型蓝舌病病毒的可靠检测。

关键词：蓝舌病病毒血清型实时荧光定量PCR 基因检测

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蓝舌病病毒荧光定量RT-PCR检测技术

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中国动物传染病学报 2009年第4期17卷 7-10页

作者：尹惠琼张红刘松婷杨姝史利军张改平章金刚军事医学科学院野战输血研究所国家生物医学分析中心病毒检测实验室北京100850 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室郑州450002

蓝舌病是一种侵害反刍动物的虫媒传染病,被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)列为上报疾病,我国将其列为一类动物疫病。本研究利用计算机软件分析获取蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)核酸检测的保守靶序列,... 详细信息

蓝舌病是一种侵害反刍动物的虫媒传染病,被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)列为上报疾病,我国将其列为一类动物疫病。本研究利用计算机软件分析获取蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)核酸检测的保守靶序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BTV荧光定量RT-PCR技术,进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价,并对动物样品进行检验。结果显示,该技术可有效检出不同血清型BTV,与流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)无交叉反应;对RNA标准品的检测灵敏度为102copies;重复检测CV<5%,可对动物样品进行有效检测。因此,所建立的BTV TaqMan/荧光定量RT-PCR技术可为蓝舌病诊断提供一种快速、可靠的病原检测手段。

关键词：蓝舌病病毒实时定量RT-PCR TaqMan荧光探针

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反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的表达

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生物技术通讯 2012年第5期23卷 686-689页

作者：罗佳张念孙宇吴健敏陆芹章马玉媛章金刚广西大学动物科学技术学院广西南宁530005 军事医学科学院野战输血研究所/国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室北京100850 广西兽医研究所广西南宁530001

目的：利用反转录病毒载体构建猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白（APOBEC）3F重组质粒,并实现其在猪肾细胞PK15中的表达。方法：用RT-PCR方法扩增五指山猪来源的外周血淋巴细胞APOBEC3F基因,将其定点插入反转录病毒载体pMSCV neo中... 详细信息

目的：利用反转录病毒载体构建猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白（APOBEC）3F重组质粒,并实现其在猪肾细胞PK15中的表达。方法：用RT-PCR方法扩增五指山猪来源的外周血淋巴细胞APOBEC3F基因,将其定点插入反转录病毒载体pMSCV neo中,同时于插入位点两侧分别添加FLAG和GFP标签,构建重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的重组质粒与pVSV-G、pGag-Pol共转染包装细胞HEK293T,分别于转染后48~72 h收集细胞的培养上清以获得假型病毒粒子;用该假型病毒感染猪源细胞PK15,通过PCR、Western印迹检测目的基因的整合及表达。结果：PCR扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP经酶切、测序,结果无误;3质粒共转染HEK293T细胞包装出的假型病毒感染PK15细胞后观察到GFP表达;从感染假型病毒的PK15细胞基因组中扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,Western印迹检测到78.1×103的猪APOBEC3F蛋白的表达。结论：实现了反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的整合与表达,为深入研究该分子对猪内源性反转录病毒（PERV）的抑制作用奠定了基础。

关键词：猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F 反转录病毒载体假型病毒真核表达

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蓝舌病病毒系列诊断检测技术研究

蓝舌病病毒系列诊断检测技术研究

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：尹惠琼杨姝张立营张红吕茂民李文超张改平章金刚军事医学科学院野战输血研究所国家生物医学分析中心/病毒安全检测实验室河南省农业科学院动物免疫学重点实验室

蓝舌病(Bluetongue,BT)是一种经吸血昆虫传播,引起反刍动物疫病的急性病毒性传染病,是世界动物卫生组织(OIE)规定的上报疾病(以前为A类传染病)[1],我国将其列为一类动物疫病。蓝舌病对动物和动物制品国际间贸易

关键词： BTV 急性病毒性传染病反刍动物特异性检测核酸检测符合率参考毒株一类动物疫病检测试剂盒环状病毒属动物制品吸血昆虫 ELISA 世界动物卫生组织

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蓝舌病系列检测技术

蓝舌病系列检测技术

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第四届全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：尹惠琼杨姝张立营张红李文超张改平章金刚军事医学科学院野战输血研究所国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室北京100850 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室郑州450002

蓝舌病(BT)是一种经吸血昆虫传播，引起反刍动物疫病的急性病毒性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为上报疾病(以前为A类传染病)，我国列为一类动物疫病。本文对BTV核酸RT-PCR检测试剂、荧光定量PCR检测试剂、抗原ELISA检测试剂、抗体... 详细信息

蓝舌病(BT)是一种经吸血昆虫传播，引起反刍动物疫病的急性病毒性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为上报疾病(以前为A类传染病)，我国列为一类动物疫病。本文对BTV核酸RT-PCR检测试剂、荧光定量PCR检测试剂、抗原ELISA检测试剂、抗体C-ELISA检测试剂以及BTV生物条形码检测技术进行了介绍。

关键词：蓝舌病病毒病毒感染免疫学检验抗体测定生物条形码检测技术

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