检索结果-内蒙古大学图书馆

安徽医科大学学报 2024年第7期59卷 1213-1218页

作者：郑蕊杨晓岚王慧罗德炎安徽医科大学基础医学院合肥230032 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071

目的制备运载双层抗原的CS-PLGA微球制剂,并对其进行相关表征鉴定。方法通过复乳法结合溶剂挥发法制备得到多孔微球后,在4℃水浴条件下装载抗原,利用抗原浓度梯度介导的物理扩散促进抗原进入微球内部,并通过静电作用结合在微球外表面,... 详细信息

目的制备运载双层抗原的CS-PLGA微球制剂,并对其进行相关表征鉴定。方法通过复乳法结合溶剂挥发法制备得到多孔微球后,在4℃水浴条件下装载抗原,利用抗原浓度梯度介导的物理扩散促进抗原进入微球内部,并通过静电作用结合在微球外表面,形成内外双层抗原运载。根据聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)材料玻璃转化温度这一特性,促进多孔微球表面孔道在48℃条件下发生愈合,使其形成闭合的微球制剂,再将得到的微球制剂与壳聚糖溶液混悬镀层,进行阳离子修饰,逆转微球表面负性电位。通过扫描电子显微镜、动态光散射粒度仪等检测微球形态、粒径分布和电位变化,采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定抗原是否装载至微球制剂中,采用荧光标记的BSA和荧光标记的PLGA材料进行激光共聚焦显微镜观察抗原装载后的分布情况,通过BCA法检测微球制剂的包封率和载药率。结果扫描电镜和光学显微镜结果显示多孔微球成孔良好,粒径大小为(73.94±0.81)nm,多分散性指数为0.038±0.004。Zeta电位由负转正说明壳聚糖已被成功镀层至微球表面。经过SDS-PAGE、激光共聚焦显微镜等证实BSA已被成功运载。经micro BCA试剂盒检测后多孔微球包封率为(3.01±0.04)%,载药率为(1.50±0.02)%。结论成功制备得到运载双层抗原的CS-PLGA制剂,为后续缓控释制剂研究提供新思路。

关键词：聚乳酸-羟基乙酸共聚物壳聚糖多孔微球抗原装载自愈合

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高毒力且高耐药铜绿假单胞菌感染小鼠肺炎模型的构建与特征分析

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军事医学 2024年第2期48卷 101-107页

作者：王林张再青陈方舟吴妮尔周冬生胡凌飞军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071 解放军总医院京北医疗区北京100094

目的选用高毒力且高耐药铜绿假单胞菌(PA)F291007株建立C57BL/6J小鼠气溶胶吸入感染肺炎模型,并研究该模型的病原学、病理学、免疫学特征。方法首先,对F291007株进行分离和鉴定。其次,将菌液经液体气溶胶肺递送途径感染小鼠建立肺炎感... 详细信息

目的选用高毒力且高耐药铜绿假单胞菌(PA)F291007株建立C57BL/6J小鼠气溶胶吸入感染肺炎模型,并研究该模型的病原学、病理学、免疫学特征。方法首先,对F291007株进行分离和鉴定。其次,将菌液经液体气溶胶肺递送途径感染小鼠建立肺炎感染模型。在感染过程中,观察小鼠状态及存活状况,检测主要脏器的细菌载量、组织病理和细胞因子变化。最后对关键细胞因子进行封闭处理,观察小鼠存活情况。结果成功分离鉴定F291007株。致死剂量感染小鼠后死亡时间集中在1 d内。亚致死剂量感染小鼠后,机体内大量免疫细胞发挥吞噬、杀伤入侵病原体作用,表现为肺部细菌被快速清除,细菌载量随时间延长呈指数下降。肺部病理改变以1~3 d最为严重,之后逐渐恢复。感染后小鼠肺泡灌洗液和血清中白细胞介素-6(IL-6)、IL-17A和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在1~3 d分泌显著升高。抗体封闭3种细胞因子后,感染小鼠存活率出现显著下降。结论成功构建了小鼠PA吸入感染肺炎恢复模型,并通过多种指标明确了1~3 d是小鼠感染后的免疫应答关键期。该小鼠模型可用于深入开展高毒力且高耐药PA吸入感染肺炎的发病机制、免疫调控、治疗评价等研究,可为开发新型治疗手段提供重要的实验基础,具有良好的应用价值。

关键词：铜绿假单胞菌肺部感染气溶胶小鼠模型

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MHC功能及其转基因小鼠模型的研究进展

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中国比较医学杂志 2024年第6期34卷 151-160页

作者：曹湘雯李敏殷琦韩雪莲王原赵光宇牡丹江医学院公共卫生学院黑龙江牡丹江157011 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)与机体免疫调节密切相关,不仅具有遗传多态性,而且MHC限制性存在种属差异。人类的MHC被称为人白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA),小鼠MHC则被称为H-2。构建人源化... 详细信息

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)与机体免疫调节密切相关,不仅具有遗传多态性,而且MHC限制性存在种属差异。人类的MHC被称为人白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA),小鼠MHC则被称为H-2。构建人源化MHC转基因小鼠模型是突破MHC种属差异并模拟人体免疫应答特征的重要策略。MHC转基因小鼠主要分为MHCⅠ或MHCⅡ单转基因小鼠模型和MHCⅠ与MHCⅡ双转基因小鼠模型。HLAⅠ类转基因小鼠模型发展经历了3个阶段,目前采取敲除H-2Kb和H-2Db或者敲除鼠源β2m的策略来消除内源的H-2Ⅰ类分子对HLAⅠ类分子的竞争性抑制;HLAⅡ类转基因小鼠模型的构建则是将鼠源β链敲除,转入HLAⅡ类基因。随着构建策略的优化,MHC转基因小鼠模型被应用于表位疫苗研发、肿瘤治疗及疾病遗传关联研究中,成为临床前试验的有力工具。本文对MHC转基因小鼠模型相关资料进行了总结,概述了MHC转基因小鼠模型的构建策略及其在疫苗研发、疾病治疗等方面的应用进展。

关键词：主要组织相容性复合体小鼠模型免疫表位疫苗肿瘤治疗

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B型肉毒毒素轻链荧光表达细胞模型的构建及应用

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军事医学 2023年第12期47卷 907-912页

作者：谭玲朱晨思王保刚李涛王慧军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的构建B型肉毒毒素轻链(BoNT/B,BLC)荧光表达细胞模型,并用于小分子化合物效应评价。方法将BLC基因导入荧光表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒,并将其转染至神经细胞系Neuro-2a细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察细胞内BLC-EGFP蛋白... 详细信息

目的构建B型肉毒毒素轻链(BoNT/B,BLC)荧光表达细胞模型,并用于小分子化合物效应评价。方法将BLC基因导入荧光表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒,并将其转染至神经细胞系Neuro-2a细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察细胞内BLC-EGFP蛋白荧光表达水平,利用Western印迹法检测细胞中BLC-EGFP的酶切活性和稳定性,进一步利用该模型评价SRC激酶抑制剂KX2-391对BLC-EGFP蛋白胞内稳定性的影响。结果成功构建重组表达质粒pEGFP-N1-BLC。质粒转染后,BCL-EGFP蛋白在Neuro-2a细胞中的表达水平随时间逐渐增加并具有酶切胞内底物囊泡相关蛋白-2(VAMP-2)的活性;质粒转染12 h后加入CHX终止蛋白合成,BLC-EGFP的胞内水平在72 h内无显著变化;加入KX2-391作用24 h后,可显著促进BLC-EGFP蛋白的胞内降解。结论成功建立B型肉毒毒素轻链荧光表达细胞模型,为后续B型肉毒毒素轻链胞内持留机制研究和胞内解毒剂筛选提供了技术储备。

关键词： B型肉毒毒素轻链基因重组重组荧光质粒 Neuro-2a细胞

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猴痘自组装纳米颗粒候选疫苗的制备及免疫应答特征研究

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免疫学杂志 2024年第1期40卷 96-103页

作者：谭凌云王慧杨晓岚汪芳洲李燕罗德炎谷宏婧安徽医科大学基础医学院合肥230032 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071

目的本研究旨在制备自组装纳米颗粒猴痘候选疫苗并研究其免疫应答特征,为其疫苗设计提供可参考的试验数据。方法利用原核系统表达纯化抗原蛋白A29L-SpyTag和骨架蛋白Mi3-SpyCatcher,化学组装制备纳米颗粒A29L-Mi3,皮下免疫小鼠,通过EL... 详细信息

目的本研究旨在制备自组装纳米颗粒猴痘候选疫苗并研究其免疫应答特征,为其疫苗设计提供可参考的试验数据。方法利用原核系统表达纯化抗原蛋白A29L-SpyTag和骨架蛋白Mi3-SpyCatcher,化学组装制备纳米颗粒A29L-Mi3,皮下免疫小鼠,通过ELISA测定抗体效价、空斑试验测定抗体中和、流式细胞术测定淋巴细胞分泌细胞因子情况,并描述其免疫应答特征。结果成功制备A29L-Mi3纳米颗粒,颗粒呈中空笼状均匀分布,其粒径平均为(29±0.19) nm。A29L-Mi3纳米颗粒候选疫苗联合SP01佐剂后,中和抗体效价强于A29L蛋白候选疫苗,且A29L-Mi3纳米颗粒候选疫苗免疫2次即能够获得免疫3次相近滴度的中和抗体。A29L-Mi3纳米颗粒候选疫苗激活的小鼠T淋巴细胞免疫应答水平高于A29L蛋白候选疫苗。结论成功体外组装制备出结构均一的A29L-Mi3蛋白纳米颗粒,具有较强的免疫原性,联合SP01佐剂后中和能力提高,为免疫程序的优化提供参考数据。细胞免疫应答水平均高于单独的A29L蛋白,为猴痘疫苗的设计与研发提供借鉴。

关键词：猴痘抗原A29L 自组装纳米颗粒疫苗体液免疫细胞免疫

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肠致病性大肠杆菌效应因子E2348C-1040泛素连接酶活性及泛素链连接方式的鉴定

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军事医学 2023年第3期47卷 182-187页

作者：黄炎玉李崭陈芳红李涛王慧军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的鉴定肠致病性大肠杆菌(EPEC)效应因子E2348C-1040泛素连接酶活性,检测其催化形成的泛素链的连接方式。方法构建原核表达质粒,转化感受态细胞,表达纯化E2348C-1040蛋白质。通过体外泛素化实验鉴定其泛素连接酶活性,利用泛素赖氨酸位... 详细信息

目的鉴定肠致病性大肠杆菌(EPEC)效应因子E2348C-1040泛素连接酶活性,检测其催化形成的泛素链的连接方式。方法构建原核表达质粒,转化感受态细胞,表达纯化E2348C-1040蛋白质。通过体外泛素化实验鉴定其泛素连接酶活性,利用泛素赖氨酸位点突变蛋白结合Western印迹实验检测该分子催化形成的泛素链的连接位点。结果成功构建原核表达质粒,获得纯度大于85%、浓度约为0.5 mg/ml的E2348C-1040蛋白质。分子水平的酶活实验结果表明E2348C-1040分子具有泛素连接酶活性,能催化形成不依赖于赖氨酸的泛素链。通过构建真核表达质粒转染HEK-293T细胞,发现E2348C-1040分子可在宿主细胞中催化形成甲硫氨酸(methionine 1,M1)连接的线性泛素链。结论EPEC效应因子E2348C-1040具有泛素连接酶活性,能催化泛素形成M1连接的线性泛素链。这一发现将为揭示效应因子E2348C-1040在宿主细胞内的作用机制提供研究线索。

关键词：肠致病性大肠杆菌效应因子泛素化泛素连接酶

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宿主ARF4和ARF5基因敲除小鼠的构建及其在寨卡病毒感染中的作用

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生物工程学报 2024年第12期40卷 4605-4615页

作者：邓考李明圆张惠莹邓永强秦源秦成峰福建农林大学生命科学学院福建福州350002 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所、病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071 香港中文大学化学病理系、李嘉诚健康科学研究所中国香港999077

本研究旨在构建宿主ADP-核糖基化因子4(ADP-ribosylation factor 4,ARF4)和ADP-核糖基化因子5(ADP-ribosylation factor 5,ARF5)基因敲除小鼠,明确ARF4和ARF5基因对寨卡病毒感染的作用。首先利用CRISPR-Cas9技术,获得ARF4和ARF5单基因敲除小鼠(ARF4KO和ARF5KO),并通过杂交繁育获得双基因敲除小鼠(ARF4KO/ARF5KO),通过PCR法鉴定小鼠基因型,定量RT-PCR法检测目标基因的敲除效果。之后,用寨卡病毒感染基因敲除小鼠,采集第2、4、6天小鼠血液和各组织样本,提取核酸后用RT-q PCR法检测病毒载量,用HE染色观察组织病理变化。结果显示,用ARF4和ARF5特异引物,分别在ARF4KO^(–/+)、ARF5KO^(–/–)以及ARF4KO^(–/+)/ARF5KO^(–/–)小鼠扩增到与目标基因大小一致的条带。RT-qPCR检测结果显示,ARF4KO^(–/+)小鼠各组织中ARF4mRNA水平显著降低,其敲除效率在37.8%-50.0%之间,ARF5表达水平无变化。ARF5KO^(–/–)小鼠组织中ARF5 mRNA完全敲除,ARF4无变化。ARF4KO^(–/+)/ARF5KO^(–/–)小鼠在肺、肾和睾丸中ARF4mRNA水平显著降低,ARF5完全敲除。最后,用寨卡病毒分别感染基因敲除小鼠和野生型小鼠。结果显示,与野生型小鼠相比,ARF4KO^(–/+)小鼠在各时间点血清中病毒载量均显著下降,但ARF5KO^(–/–)小鼠与ARF4KO^(–/+)/ARF5KO^(–/–)小鼠无明显变化。同时,与野生型小鼠相比,ARF4KO^(–/+)小鼠各组织病毒载量没有显著降低,但其大脑和睾丸的病理性改变减轻。本研究利用CRISPR-Cas9技术成功构建了ARF4和ARF5基因敲除小鼠,并证实ARF4是寨卡病毒感染必需的宿主蛋白,为后续深入研究ARF4和ARF5在寨卡病毒感染致病中的作用机制以及抗病毒药物研发奠定了基础。

关键词： CRISPR-Cas9技术基因敲除小鼠 ADP-核糖基化因子4 ADP-核糖基化因子5

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痘苗病毒蛋白D8纳米抗体的原核表达及结合活性分析

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中国兽医学报 2024年第8期44卷 1728-1734页

作者：田婧婧杨晓岚李涛王慧范瑞文山西农业大学动物医学学院山西太谷030801 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

利用SUMO标签制备痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)蛋白D8的纳米抗体,并分析其与抗原是否具有结合活性。设计并合成序列,构建原核表达质粒pKMD-SUMO-D8,将其转化大肠杆菌(Escherichia coli,***)BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达;纯化带有Hi... 详细信息

利用SUMO标签制备痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)蛋白D8的纳米抗体,并分析其与抗原是否具有结合活性。设计并合成序列,构建原核表达质粒pKMD-SUMO-D8,将其转化大肠杆菌(Escherichia coli,***)BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达;纯化带有His标签和SUMO标签的抗体Anti-SUMO-D8,之后利用SUMO蛋白酶切除His标签和SUMO标签,进一步获得Anti-D8;最后,应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及间接免疫荧光试验(IFA)对其结合活性进行检测并分析。结果显示,成功构建了原核表达质粒pKMD-SUMO-D8和重组菌株,在30℃条件下,终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达菌株4 h时,Anti-SUMO-D8表达量最佳;获得了高纯度的Anti-SUMO-D8和Anti-D8纳米抗体;间接ELISA结果显示,Anti-SUMO-D8和Anti-D8与抗原均具有结合活性;在相同条件下,Anti-D8与VACV及E8L的结合活性高于Anti-SUMO-D8。间接IFA结果显示,VACV侵染48 h后,试验组部分细胞核在荧光显微镜下可见绿色荧光。利用SUMO标签可高效制备VACV蛋白D8的纳米抗体,且制备的纳米抗体具有一定的结合活性。本研究结果为纳米抗体的制备提供了新思路,也为深入研究VACV蛋白D8纳米抗体的生物学功能奠定了基础。

关键词：痘苗病毒纳米抗体 SUMO 结合活性

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基于同源重组原理快速验证fim家族基因簇对鲍曼不动杆菌蹭动的影响

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安徽医科大学学报 2024年第1期59卷 8-14页

作者：孙千姿宁年智王慧安徽医科大学基础医学院合肥230032 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的旨在利用含有抗生素耐药盒的线性PCR片段对鲍曼不动杆菌靶基因片段进行同源重组替换,实现基因的快速敲除及功能验证。方法以鲍曼不动杆菌Ab4294菌株为研究对象,PCR分别扩增fim基因簇(全长4980 bp)上游901 bp、下游1028 bp的序列作... 详细信息

目的旨在利用含有抗生素耐药盒的线性PCR片段对鲍曼不动杆菌靶基因片段进行同源重组替换,实现基因的快速敲除及功能验证。方法以鲍曼不动杆菌Ab4294菌株为研究对象,PCR分别扩增fim基因簇(全长4980 bp)上游901 bp、下游1028 bp的序列作为重组的同源臂;从pUC57质粒中扩增获得卡那霉素抗生素耐药盒(KanR);利用重叠延伸PCR技术将上述3个片段连接,并将连接片段转化至鲍曼不动杆菌Ab4294中,筛选获得基因缺失突变株,构建质粒回补株,对所得菌株进行表型鉴定,探究fim基因簇的功能。结果利用含有抗生素耐药盒的线性PCR片段同源替换的方法成功构建了fim基因簇缺失的鲍曼不动杆菌Ab4294突变菌株;缺失菌株与野生株相比生长速率无明显差异,蹭动运动能力明显下降,回补该基因簇后表型恢复。结论利用含有抗性耐药盒的线性PCR片段同源替换的方法成功敲除鲍曼不动杆菌Ab4294的fim家族基因簇,该基因簇编码产物参与鲍曼不动杆菌的蹭动运动。

关键词：鲍曼不动杆菌基因敲除 fim基因簇蹭动运动

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猴痘病毒蛋白的原核表达及免疫效果评价

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病毒学报 2024年第4期40卷 772-778页

作者：王雪琛李涛杨晓岚孙娅坤王慧王凤雪内蒙古农业大学兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室呼和浩特010018 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071

猴痘是由猴痘病毒引起的一种人兽共患疾病。研发特异性预防和治疗猴痘的疫苗或药物成为目前全球研究重点之一。本研究以猴痘主要抗原蛋白其中的A29L、E8L、M1R为研究基础,加入His标签构建质粒、原核表达、纯化,并对表达蛋白进行SDS⁃PAGE... 详细信息

猴痘是由猴痘病毒引起的一种人兽共患疾病。研发特异性预防和治疗猴痘的疫苗或药物成为目前全球研究重点之一。本研究以猴痘主要抗原蛋白其中的A29L、E8L、M1R为研究基础,加入His标签构建质粒、原核表达、纯化,并对表达蛋白进行SDS⁃PAGE及Western blot鉴定其特异性。后续将3种抗原蛋白与CpG⁃ODN 1826单佐剂、铝单佐剂或CpG与铝复合佐剂三次免疫小鼠,通过酶联免疫吸附实验及病毒蚀斑减少中和实验测定三价疫苗的结合抗体和中和抗体能力。结果表明,重组蛋白A29L、E8L、M1R诱导后均可溶性表达且表达量及纯度良好。三价疫苗以CpG⁃ODN 1826佐剂联合铝佐剂施行肌肉注射一组表现出较好的结合抗体和中和抗体能力。本研究为研发特异性针对猴痘的疫苗或药物提供基础。

关键词：猴痘猴痘病毒原核表达蛋白纯化佐剂

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