检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物化学与分子生物学报 2008年第4期24卷 366-372页

作者：张松林金梅林肖凌云陈焕春华中农业大学农业微生物动物传染病国家重点实验室

通过将高致病性禽流感病毒HA蛋白整合到HIV颗粒,包装成表达HA蛋白的假病毒粒子(命名为HIV/H5-HA),并对所包装的假病毒的生物学功能进行了研究.通过RT-PCR获得了H5N1亚型禽流感病毒完整的血凝素基因(HA)并克隆到真核表达载体pcDNA3·... 详细信息

通过将高致病性禽流感病毒HA蛋白整合到HIV颗粒,包装成表达HA蛋白的假病毒粒子(命名为HIV/H5-HA),并对所包装的假病毒的生物学功能进行了研究.通过RT-PCR获得了H5N1亚型禽流感病毒完整的血凝素基因(HA)并克隆到真核表达载体pcDNA3·1(+)上,通过与假病毒构建体系的2种质粒pCMV△8·2和pHR′-CMVLacZ共转染293T细胞,包装成假病毒颗粒.利用LacZ染色和HA假病毒颗粒感染MDCK等6种细胞株并对标记基因LacZ进行检测.结果表明,HIV/H5-HA与天然的禽流感病毒相似,具有广泛的细胞嗜性;Western印迹和FACS检测结果,和HA假病毒颗粒的电镜照片确认了HA基因在假病毒颗粒表面得到了表达;HIV/H5-HA能够凝集鸡红细胞,并且pH值依赖性测定表明,HA假病毒需要低pH值才能实现正确的入侵宿主细胞.本研究结果显示:禽流感病毒H5N1亚型的HA基因得到了有效的包装,并且所包装的假病毒颗粒能够表达具有高度生物活性的HA蛋白.同时,假病毒模型的建立为进一步研究禽流感病毒与宿主之间的免疫应答提供了一种新的途径.

关键词：禽流感病毒血凝素蛋白假病毒 pH依赖性

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N-糖基化对乙型脑炎病毒prME和NS1基因免疫效果影响的研究

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病毒学报 2012年第3期28卷 213-218页

作者：张子重汪雪宰俊杰孙乐强宋云峰陈焕春华中农业大学动物医学院动物传染病室武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

prME和NS1为乙型脑炎病毒两个主要的免疫保护蛋白,且均为N-糖蛋白。为研究N-糖基化对乙型脑炎病毒免疫保护的作用,本研究用PCR介导的定点突变方法,分别消除乙型脑炎病毒prME和NS1基因的不同N-糖基化位点,并构建了prME和NS1突变基因的真... 详细信息

prME和NS1为乙型脑炎病毒两个主要的免疫保护蛋白,且均为N-糖蛋白。为研究N-糖基化对乙型脑炎病毒免疫保护的作用,本研究用PCR介导的定点突变方法,分别消除乙型脑炎病毒prME和NS1基因的不同N-糖基化位点,并构建了prME和NS1突变基因的真核表达质粒。将质粒免疫四周龄雌性小白鼠,经两次免疫后,采集血清检测体液免疫反应,最后对小鼠用强毒进行攻击,观察并记录免疫保护力。研究结果显示,与野生型prME基因免疫组相比,消除单个糖基化位点后prME基因诱导的ELISA抗体、中和抗体和免疫保护力均略有升高,而同时消除两个糖基化位点的则会降低。NS1基因消除单个糖基化位点后保护率高达到100%,但消除两个糖基化位点后则免疫保护率略有降低(75%)。通过本研究证明,N-糖基化在维系乙型脑炎病毒prME和NS1蛋白的免疫保护中具有重要的作用,单个糖基化的缺失可增强蛋白的免疫原性,而两个糖基都缺失后,则造成了免疫效率的降低。

关键词：乙型脑炎病毒 prME基因 NS1基因 N-糖基化免疫

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O型口蹄疫多基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

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中国兽医学报 2009年第10期29卷 1286-1289页

作者：张克山向敏吴斌徐卓菲蔡利军王勤刚陈焕春华中农业大学动物医学院动物传染病实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

根据GenBank公布的序列设计1对引物扩增O型口蹄疫病毒P12A3C基因并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV内。含有目的基因的穿梭质粒(pShuttle-PAC)线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细菌。利用细菌内... 详细信息

根据GenBank公布的序列设计1对引物扩增O型口蹄疫病毒P12A3C基因并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV内。含有目的基因的穿梭质粒(pShuttle-PAC)线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细菌。利用细菌内同源重组法得到重组腺病毒质粒(pAd-PAC)。在Lipofectamine 2000介导下重组腺病毒质粒转染HEK293细胞得到重组腺病毒(Ad-PAC)。半数组织培养感染剂量(TCID50)测定、免疫荧光试验(IFA)和连续传代后目的基因的PCR扩增,证实重组病毒滴度为105.5TCID50/0.1 mL,重组病毒HEK293细胞中得以表达且遗传稳定性良好;动物试验表明,该重组病毒能够诱导小鼠产生较高水平的针对口蹄疫病毒的特异性抗体;本试验为口蹄疫重组腺病毒活载体疫苗的进一步研究和应用奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒腺病毒重组病毒免疫原性

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猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因的克隆与表达

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中国兽医学报 2006年第3期26卷 271-274页

作者：王大鹏吴斌周锐唐先春陈焕春华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物传染病分室湖北武汉430070

皮肤坏死毒素(Dermonecrotictoxin,DNT)是产毒素多杀性巴氏杆菌(ToxigenicPasteurellamultocida,T+Pm)的主要毒力因子和保护性抗原。以猪源D型T+Pm的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到了编码DNT的toxA全基因编码序列,共4019bp。将其克隆到pMD18-T载体并测序,结果表明,toxA基因序列与GenBank已报道的5个toxA基因序列的同源性达99.8%以上。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-KG的GST基因下游,转化BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达,获得大小约173000的融合蛋白。Westernblot结果表明,该融合蛋白具有良好的反应原性。动物试验表明,该重组蛋白可以诱导小鼠产生高水平的抗体,并可抵抗致死剂量的天然DNT毒素攻击。

关键词：猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌 toxA基因克隆表达

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N-糖基化对乙型脑炎病毒感染与增殖的影响

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农业生物技术学报 2012年第3期20卷 316-320页

作者：张子重汪雪宋云峰陈焕春华中农业大学动物医学院动物传染病室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室

N-糖基化对于病毒的感染与增殖中均具有重要作用,切除病毒表面糖链或抑制病毒糖基化修饰的方法已成为登革热病毒等的潜在治疗方法。为阐明日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)表面的糖链在其感染和增殖过程中的作用,本... 详细信息

N-糖基化对于病毒的感染与增殖中均具有重要作用,切除病毒表面糖链或抑制病毒糖基化修饰的方法已成为登革热病毒等的潜在治疗方法。为阐明日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)表面的糖链在其感染和增殖过程中的作用,本研究用肽N-糖苷酶F(peptide N-glycosidase F,PNGase F)和内切糖苷酶H(endoglycosidase H,Endo H)处理乙型脑炎病毒,将酶切后的病毒用Western blot验证糖基化酶切的效果,将酶切的JEV接种BHK-21细胞进行蚀斑试验,观察蚀斑的大小及病毒滴度的变化情况。同时用衣霉素处理BHK-21细胞并同步接种JEV,进行蚀斑试验,观察蚀斑大小的变化与病毒增殖情况。结果显示,用Endo H和PNGase F处理JEV后,病毒形成的蚀斑均显著小于未处理的病毒对照,且病毒增殖滴度显著降低,说明病毒粒子表面的糖基化修饰对于病毒的侵染具有重要作用。衣霉素处理细胞后,病毒产生的蚀斑大小没有明显差异,但增殖滴度却显著降低,说明糖基化在JEV增殖过程中也具有重要的功能。本研究说明JEV的糖基化对于其感染和增殖均具有重要的作用,为开发抑制乙型脑炎病毒药物研究提供一个新的思路。

关键词：日本乙型脑炎病毒糖苷酶 N-糖基化感染增殖

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临床分离猪链球菌和副猪嗜血杆菌多重耐药性监测

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华中农业大学学报 2012年第5期31卷 623-628页

作者：胡军勇汤细彪汤电刘望宏倪德斌吴斌华中农业大学动物科技学院武汉430070 华中农业大学动物传染病诊断中心武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

为了解我国规模化猪场链球菌和副猪嗜血杆菌的耐药情况,用纸片扩散法对临床分离的112株猪链球菌和92株副猪嗜血杆菌进行23种药物的敏感性试验。结果表明,猪链球菌对林可胺类、大环内酯类、硝基呋喃类药物的耐药率均在90%以上,对链霉素... 详细信息

为了解我国规模化猪场链球菌和副猪嗜血杆菌的耐药情况,用纸片扩散法对临床分离的112株猪链球菌和92株副猪嗜血杆菌进行23种药物的敏感性试验。结果表明,猪链球菌对林可胺类、大环内酯类、硝基呋喃类药物的耐药率均在90%以上,对链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、多西环素的耐药率在60%～90%之间,而对β-内酰胺类和氟喹诺酮类的耐药率相对较低。副猪嗜血杆菌对四环素耐药率最高(78.3%),对螺旋霉素、复方磺胺甲噁唑、克林霉素、阿米卡星、林可霉素、新霉素的耐药率在50%～70%之间,对头孢类和氟喹诺酮类耐药率相对较低。2种细菌对不同种类药物的敏感性各异,并且多重耐药性严重,主要耐药谱具有多样性。

关键词：猪链球菌副猪嗜血杆菌多重耐药性耐药率

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胸膜肺炎放线杆菌基因分型方法的建立及其临床应用

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微生物学报 2004年第5期44卷 679-682页

作者：陈凡陈美玲陈焕春何启盖 PatBlackall 华中农业大学农业微生物国家重点实验室动物传染病室武汉430070 澳大利亚动物保健研究所

根据胸膜肺炎放线杆菌各血清型之间外毒素 (Apx) ,外膜脂蛋白 (OmlA) ,转铁蛋白B(TbpB)的基因差异 ,分别对各血清型进行PCR扩增 ,得到不同的特异性片段 ,可区分开生物Ⅰ型 13个标准菌株血清型中的 8个血清型。临床检测结果与血清学分型... 详细信息

根据胸膜肺炎放线杆菌各血清型之间外毒素 (Apx) ,外膜脂蛋白 (OmlA) ,转铁蛋白B(TbpB)的基因差异 ,分别对各血清型进行PCR扩增 ,得到不同的特异性片段 ,可区分开生物Ⅰ型 13个标准菌株血清型中的 8个血清型。临床检测结果与血清学分型一致 ,将此分型系统用于临床送检的 12 6份肺脏和 4 2份扁桃体的病原学检测 ,可直接检测出胸膜肺炎放线杆菌感染。此方法还可以将一些尚未定型的菌株进行归类 ,弥补了血清学方法的不足 ,为细菌的流行病学调查提供了可靠的技术手段。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 PCR 基因分型病原学检测

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猪库布病毒RT-PCR检测方法的建立及湖北省流行病学初步调查

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华中农业大学学报 2012年第4期31卷 485-489页

作者：胡军勇汤细彪胡睿铭刘望宏倪德斌吴斌华中农业大学动物科技学院武汉430070 华中农业大学动物传染病诊断中心武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

根据猪库布病毒的3 D基因设计1对引物,建立了两步法RT-PCR检测方法,使用该方法分别对CSFV、PRRSV、JEV、SIV、PEDV、TGEV、GARV阳性模板及包含猪肠道病毒3 D基因和口蹄疫病毒3 D基因的重组质粒进行PCR检测,结果从以上9种常见猪病病原的... 详细信息

根据猪库布病毒的3 D基因设计1对引物,建立了两步法RT-PCR检测方法,使用该方法分别对CSFV、PRRSV、JEV、SIV、PEDV、TGEV、GARV阳性模板及包含猪肠道病毒3 D基因和口蹄疫病毒3 D基因的重组质粒进行PCR检测,结果从以上9种常见猪病病原的阳性模板中均不能扩增出323bp大小的PCR产物,说明该检测方法的特异性很好,能够用作临床样品的检测。敏感性试验显示,本试验建立的检测方法能够检测到的模板最低质量浓度为180fg/mL。应用该方法对湖北省各大猪场进行了临床病料检测,在采集的165份病料中有118份样品检测为猪库布病毒阳性。在4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示,猪库布病毒在猪群中集中分布在发生腹泻疫情的猪群,说明猪库布病毒和现阶段的腹泻疫情有紧密的联系。

关键词：猪库布病毒 RT-PCR 检测方法腹泻流行病学调查

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猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其初步流行病学调查

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中国预防兽医学报 2012年第8期34卷 632-636页

作者：胡军勇张倩王丹丹涂志勤胡睿铭汤细彪吴斌华中农业大学动物科技学院湖北武汉430070 华中农业大学动物传染病诊断中心湖北武汉430070 农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

猪博卡病毒(PBoV)是一种新出现的病毒,可以导致仔猪急性腹泻。为建立该病毒的检测方法,本实验根据PBoV的NS1基因序列设计一对引物,建立了PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法能够从PBoV阳性样品中特异性的扩增出482 bp的片段,而对... 详细信息

猪博卡病毒(PBoV)是一种新出现的病毒,可以导致仔猪急性腹泻。为建立该病毒的检测方法,本实验根据PBoV的NS1基因序列设计一对引物,建立了PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法能够从PBoV阳性样品中特异性的扩增出482 bp的片段,而对猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、沙门氏菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌的核酸样品均无非特异性扩增反应。敏感性试验显示,该PCR方法对PBoV的最低检测量为213.6拷贝。此外,应用该方法对湖北、湖南、河南省的各大猪场进行了流行病学调查,在79个规模化猪场采集的248份病料样品中有172份样品为PBoV阳性。其中,对4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示PBoV在腹泻猪群中的阳性率达到73.95%,并显著高于非腹泻猪群(47.83%)。本研究调查结果显示PBoV在国内猪群中流行广泛而且感染率高。

关键词：猪博卡病毒 PCR检测方法腹泻流行病学调查

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细菌内同源重组法构建O型口蹄疫多基因重组腺病毒

细菌内同源重组法构建O型口蹄疫多基因重组腺病毒

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2006年度学术研讨会

作者：张克山吴斌姚清侠向敏徐卓菲钱平陈焕春华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物传染病实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物传染病实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物传染病实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物传染病实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物传染病实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物传染病实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物传染病实验室

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄兽的急性,烈性传染病,被国际兽医局列为一类传染病。它导致有口蹄疫爆发的地区和国家的畜产品进出口贸易停止,造成巨大的经济损失和政治影响,是一种典型的政治和经济... 详细信息

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄兽的急性,烈性传染病,被国际兽医局列为一类传染病。它导致有口蹄疫爆发的地区和国家的畜产品进出口贸易停止,造成巨大的经济损失和政治影响,是一种典型的政治和经济病。在口蹄疫的基因工程疫苗的研究过程中人们试图将结构蛋白基因P1和蛋白酶基因组合在一起,期望在免疫动物后在细胞内组装成病毒的空衣壳,模拟自然病毒表面的线性和非线性的抗原表位,刺激机体产生与自然病毒感染相近的免疫效果,国外这方面的研究有不少成功的报道。本研究利用细菌内同源重组的方法构建含有O型口蹄疫病毒 P1-2A-3C的多基因重组腺病毒。为口蹄疫重组腺病毒基因工程活载体疫苗的研究及其免疫效果的评价奠定基础。首先通过PCR的方法从阳性质粒PcDNAP1-2A-3C扩增到口蹄疫病毒P1-2A-3C基因,然后将其亚克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用多酶切图谱分析、PCR扩增及序列测定的方法证实口蹄疫病毒P1-2A-3C基因正确插入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,用Pmel酶将含有目的基因的穿梭载体线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化大肠杆菌BJ5183感受态菌,采用细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒ADPSP1-2A-3C,经序列测定,PCR扩增,Pacl酶切鉴定等证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体;将鉴定正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌XL-10进行大量扩增,用Pacl酶线性化后转染HEK293细胞,并连续在HEK293细胞传10代次,对每一代次的细胞提取基因组后通过PCR的方法扩增口蹄疫病毒P1-2A-3C基因,同时设置正常HEK293细胞对照,结果证实重组腺病毒能够在HEK293细胞稳定遗传。在第8 代中提取HEK293细胞的总RNA用口蹄疫病毒P1-2A-3C特异性引物进行RT-PCR,结果表明目的基因能够表达,在第10代次HEK293细胞的间接免疫荧光也证实口蹄疫基因在 HEK293细胞中得到表达。本研究采用细菌内同源重组的方法构建口蹄疫多基因重组腺病毒,和传统的方法比较大大提高了重组效率,构建的重组病毒的动物试验正在进行中。

关键词：同源重组方法构建口蹄疫病毒重组腺病毒 HEK

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