检索结果-内蒙古大学图书馆

微生物学报 2006年第1期46卷 158-161页

作者：曹胜波孙敏轩刘学芹刘新文陈焕春华中农业大学农业微生物学国家重点实验室

猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)是当前严重危害养猪业的重要病原之一。目前,世界上还没有有效疫苗用于该病毒的免疫预防。该研究利用PCR方法,将PCV2的ORF2基因替换猪Ⅰ型圆环病毒(PCV1)的ORF2基因,构建了以PCV1基因组为骨架的嵌合病毒(PCV1-2)分... 详细信息

猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)是当前严重危害养猪业的重要病原之一。目前,世界上还没有有效疫苗用于该病毒的免疫预防。该研究利用PCR方法,将PCV2的ORF2基因替换猪Ⅰ型圆环病毒(PCV1)的ORF2基因,构建了以PCV1基因组为骨架的嵌合病毒(PCV1-2)分子克隆(pSK2PCV1-2)。将该分子克隆转染PK-15细胞并连续盲传5代,用RT-PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV1的ORF1 mRNA和PCV2的ORF2 mRNA,但检测不到PCV1的ORF2 mRNA和PCV2的ORF1 mRNA。间接免疫荧光检测显示在盲传第5代的细胞中有PCV2 ORF2蛋白的表达,表达蛋白主要分布于细胞核。该研究初步证实构建的PCV1-2分子克隆转染细胞后可以形成具有感染性的嵌合病毒,从而为更深入研究嵌合病毒生物学特性奠定了基础。

关键词：嵌合猪圆环病毒感染性鉴定

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土壤微生物总DNA提取方法的优化

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微生物学报 2012年第9期52卷 1143-1150页

作者：赵裕栋周俊何璟华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

【目的】土壤中未培养微生物约占总量的99%,这就意味着绝大多数微生物资源还未得到开发和利用。本研究通过优化土壤微生物总DNA的提取方法,获得较高质量的DNA,为后期研究土壤微生物的多样性及构建大插入片段的宏基因组文库奠定基础。【... 详细信息

【目的】土壤中未培养微生物约占总量的99%,这就意味着绝大多数微生物资源还未得到开发和利用。本研究通过优化土壤微生物总DNA的提取方法,获得较高质量的DNA,为后期研究土壤微生物的多样性及构建大插入片段的宏基因组文库奠定基础。【方法】通过综合比较已报道的微生物DNA提取方法的优缺点,我们设计出一种新的提取方案。对提取过程中的几个关键步骤进行了优化,包括联合使用SDS-CTAB和溶菌酶一起来破细胞,利用氯仿除蛋白,使用PVPP柱纯化DNA等。比较分析了优化后的方法和3种已报道方法所获得的土壤总DNA的产量、纯度及片段大小。【结果】优化后的方法所获得的土壤DNA质量明显有所提高:每克土壤最高能提取95μg DNA,A260/A280和A260/A230比值更接近理想水平,PCR扩增能够得到明显的目标条带,DNA片段最大能达到100 kb左右。【结论】通过比较分析,最终确立了一种较理想的土壤微生物总DNA提取方法,为更好地开发利用土壤未培养微生物资源提供了有力工具。

关键词：土壤微生物 eDNA抽提 DNA的产量及质量 PCR扩增大片段DNA

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肠外致病性大肠埃希菌多重耐药性及氨基糖苷类耐药基因分析

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中国抗生素杂志 2009年第8期34卷 498-504页

作者：张璇汤细彪吴斌陈石夏欣满晓营陈焕春华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

目的检测临床分离猪、鸡源肠外致病性大肠埃希菌的耐药性,分析其携带的氨基糖苷类耐药基因,以指导临床用药,探究细菌对氨基糖苷类抗生素的抗性机制。方法应用K-B法测定分离株对19种常用抗生素的耐药情况。用双纸片法检测产ESBLs菌株并... 详细信息

目的检测临床分离猪、鸡源肠外致病性大肠埃希菌的耐药性,分析其携带的氨基糖苷类耐药基因,以指导临床用药,探究细菌对氨基糖苷类抗生素的抗性机制。方法应用K-B法测定分离株对19种常用抗生素的耐药情况。用双纸片法检测产ESBLs菌株并进行基因分型。用PCR和测序方法检测氨基糖苷类抗性基因aadA1,aadA2,strA-strB,aadB,aacC2,aac(3)-IV,aph(3′)-Ia,aph(3′)-IIa。结果临床分离株表现多重耐药性,对头孢菌素类药物和阿米卡星的敏感性最高(63%～97%),93%的菌株耐药谱值≥10。共检测到两株产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株,基因型属TEM-1+CTX-M-14。耐药菌株与相应的氨基糖苷类耐药基因符合率高(≥74%)且序列保守。结论猪、鸡源肠外致病性大肠埃希菌呈多重耐药性,其对氨基糖苷类抗生素的抗性机制以产生针对该类抗生素的修饰酶为主。

关键词：肠外致病性大肠埃希菌耐药性氨基糖苷类抗生素耐药基因型

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环境微生物群落功能研究的新方法和新策略

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生态学报 2008年第9期28卷 4424-4429页

作者：魏力杨成运李友国农业微生物学国家重点实验室华中农业大学武汉430070

微生物群落在驱动生物地球化学循环中扮演着重要角色,传统的研究方法可对微生物群落进行遗传结构的解析,但不能有效地与功能研究耦联。概述了近年发展起来的基于核酸和蛋白质水平的分子生物学新方法——环境mRNA和rRNA同时荧光原位杂交(... 详细信息

微生物群落在驱动生物地球化学循环中扮演着重要角色,传统的研究方法可对微生物群落进行遗传结构的解析,但不能有效地与功能研究耦联。概述了近年发展起来的基于核酸和蛋白质水平的分子生物学新方法——环境mRNA和rRNA同时荧光原位杂交(FISH)、寡核苷酸微阵列技术(Oligonucleotide Microarray)、稳定性同位素联合宏基因组学(SIP-enabled Metagenomics)和环境蛋白质组学(Metaproteomics)在环境微生物群落功能研究中的应用,并且对其发展趋势进行了分析和展望。

关键词：微生物群落功能荧光原位杂交寡核苷酸微阵列 SIP宏-基因组学环境蛋白质组学

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VP35蛋白对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒增殖的影响

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水产学报 2022年第2期46卷 261-269页

作者：姜霖涂加钢张永安华中农业大学水产学院农业微生物学国家重点实验室

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)基因片段S11编码外衣壳蛋白VP35。为深入探究VP35蛋白在病毒增殖中发挥的作用，实验扩增了S11基因并插入载体pCMV-3×flag中，构建pCMV-3×flag-S11真核表达质粒，转染草鱼肾细胞(CIK)后感染Ⅱ型GCRV... 详细信息

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)基因片段S11编码外衣壳蛋白VP35。为深入探究VP35蛋白在病毒增殖中发挥的作用，实验扩增了S11基因并插入载体pCMV-3×flag中，构建pCMV-3×flag-S11真核表达质粒，转染草鱼肾细胞(CIK)后感染Ⅱ型GCRV，收集感染后的上清液与细胞。首先利用实时荧光定量PCR中相对定量的方法检测细胞样品中Ⅱ型GCRV-S6基因的mRNA。结果显示，过表达VP35在病毒mRNA水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；然后扩增S6基因并插入到载体pET-32a(+)中，构建重组原核表达质粒，纯化Ⅱ型GCRV-VP4蛋白并制备多克隆抗体，用Western blot检测收集的细胞样品中的VP4蛋白，结果表明过表达VP35在病毒蛋白水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；最后使用pET-32a-S6质粒作为阳性标准质粒并制作标准曲线，建立Ⅱ型GCRV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，利用该方法检测细胞上清液中的病毒颗粒，结果表明过表达VP35增加Ⅱ型GCRV病毒拷贝数。本研究从3个维度证明过表达VP35蛋白促进Ⅱ型GCRV增殖，有助于深入解析VP35蛋白功能，也为进一步探究Ⅱ型GCRV的致病机制提供理论基础。

关键词：草鱼 Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒 VP35蛋白 VP4蛋白多克隆抗体增殖

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假单胞菌表达载体pYMB03的构建与性能分析

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应用与环境生物学报 2008年第4期14卷 528-533页

作者：叶婷姚陈李茜茜张红星李林华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是具有强抗逆性能的环境优势菌,构建其质粒表达载体有着明显的应用潜力.将恶臭假单胞菌AB92019菌株中肽聚糖相关脂蛋白编码基因的启动子PoprL和质粒载体pTrcHis-B的多克隆位点片段插入到质粒载体pUCP18... 详细信息

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是具有强抗逆性能的环境优势菌,构建其质粒表达载体有着明显的应用潜力.将恶臭假单胞菌AB92019菌株中肽聚糖相关脂蛋白编码基因的启动子PoprL和质粒载体pTrcHis-B的多克隆位点片段插入到质粒载体pUCP18的EcoRI/HindIII位点,获得了重组载体pYMB03.用绿色荧光基因gfp作为标记进行外源蛋白表达的结果表明,该载体能分别在恶臭假单胞菌AB92019菌株和大肠杆菌DH5a菌株中,由启动子PoprL启动组成型表达GFP蛋白并使细胞产生可见荧光.经SDS-PAGE验证,所产生的GFP蛋白分别占细胞总蛋白的12.5%和5.0%.重组菌株YMB001中GFP表达量与菌体培养时间有关,在稳定期后期其相对荧光强度达到最大值(D600nm=1.0),但与培养温度未见相关性.对携带该载体的2株重组恶臭假单胞菌7次168h继代培养测定,载体pYMB03的稳定性均为100%.

关键词：表达载体假单胞菌启动子构建性能

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酪蛋白水解物对雷帕霉素产生菌Streptomyces hygroscopicus ATCC29253接合转移效率的影响

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微生物学报 2012年第2期52卷 198-205页

作者：张万垚鲁慧囡何璟华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)ATCC29253能够产生非常丰富的次级代谢产物,除了雷帕霉素外,还可以分泌尼日利亚菌素、洋橄榄叶素、六烯类抗生素等多种具有生物活性的物质,具有重要的研究价值和应用前景。【目的】而建立高效的... 详细信息

吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)ATCC29253能够产生非常丰富的次级代谢产物,除了雷帕霉素外,还可以分泌尼日利亚菌素、洋橄榄叶素、六烯类抗生素等多种具有生物活性的物质,具有重要的研究价值和应用前景。【目的】而建立高效的遗传操作系统是研究该链霉菌相关代谢产物合成机理和构建基因工程菌株的基础。【方法】我们测试了不同培养基及供体菌对吸水链霉菌及其它链霉菌接合转移效率的影响。【结果】我们发现酪蛋白水解物和镁离子能显著提高*** ATCC29253接合转移效率。通过随机组合试验,筛选出最佳的MgCl2和酪蛋白水解物浓度组合,使得*** ATCC29253接合转移效率达到1.5×10-4。同时我们还发现酪蛋白水解物可以明显改变***、***、***的接合转移效率。【结论】本研究首次发现酪蛋白水解物不光对*** ATCC29253接合转移有作用,对其它常用的链霉菌如***、***、***等的接合转移效率都有显著的影响。

关键词：吸水链霉菌ATCC29253 接合转移酪蛋白水解物

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牛IFN-γ原核表达、单克隆抗体制备及其ELISA检测方法的建立

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生物工程学报 2007年第1期23卷 40-45页

作者：李川谭亚娣陈颖钰胡巧云马艳张桂荣钦博晁彦杰陈焕春郭爱珍华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

实验旨在建立牛重组IFN-γ（BovIFN-γ）的ELISA检测技术，为牛传染病的免疫学诊断提供新方法。PHA刺激体外培养的奶牛外周血白细胞，从培养细胞中提取总RNA，经过RT-PCR扩增出BovIFN-γ基因cDNA，进一步克隆至pET28a，转化大肠杆菌，经... 详细信息

实验旨在建立牛重组IFN-γ（BovIFN-γ）的ELISA检测技术，为牛传染病的免疫学诊断提供新方法。PHA刺激体外培养的奶牛外周血白细胞，从培养细胞中提取总RNA，经过RT-PCR扩增出BovIFN-γ基因cDNA，进一步克隆至pET28a，转化大肠杆菌，经IPTG诱导，表达出预期大小（18kD左右）组氨酸标记蛋白，经鉴定为BovIFN-γ；以纯化的重组BovIFN-γ为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术，获得4株能稳定分泌抗BovIFN-γ单克隆抗体的细胞株，分别命名为A7、A10、G6与G10。免疫球蛋白亚类鉴定证明杂交瘤细胞所分泌的抗体均为IgG1，腹水效价在1：2^10×100～1：2^11×100之间。Western-blot分析显示，4株单抗均能特异性结合重组BovIFN-γ。ELISA试验表明，4株单抗只与融合蛋白BovIFN-γ反应，而不与非相关性蛋白Ag85B、ESAT-6-CFP-10、GM-CSF等发生反应。选取A10细胞株分泌的单克隆抗体、纯化的多克隆抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗免IgG，建立了检测BovIFN-γ的双抗体夹心ELISA方法。实验结果表明，此方法检测敏感性达到2ng／mL，特异性良好，为进一步建立灵敏、特异的病原感染诊断方法奠定了基础。

关键词：牛IFN-γ 单克隆抗体 ELISA 克隆表达

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表达SLTEC保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌C500株的构建及生物学特性

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微生物学报 2009年第4期49卷 518-523页

作者：满晓营吴斌罗勇余腾赵战勤徐引弟郭爱珍陈焕春华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

【目的】利用平衡致死系统构建表达产类志贺氏毒素大肠杆菌(Shiga-liketoxin Escherichia coli,SLTEC)保护性抗原的减毒猪霍乱沙门氏菌。【方法】构建表达SLT-IIeB-FedF的重组质粒,再将其电转入终宿主菌减毒猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株... 详细信息

【目的】利用平衡致死系统构建表达产类志贺氏毒素大肠杆菌(Shiga-liketoxin Escherichia coli,SLTEC)保护性抗原的减毒猪霍乱沙门氏菌。【方法】构建表达SLT-IIeB-FedF的重组质粒,再将其电转入终宿主菌减毒猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株中构建成口服活疫苗株,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SLT-IIeB-FedF融合蛋白的表达情况,并观察重组菌体外培养的稳定性。【结果】利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达SLTEC保护性抗原的重组减毒猪霍乱沙门氏菌,经SDS-PAGE电泳出现了1条蛋白质量约为37kDa的蛋白条带。且在没有选择压力的条件下体外能稳定地繁殖、生长和传代。【结论】成功构建表达SLTEC保护性抗原的重组减毒猪霍乱沙门氏菌,为发展猪水肿病-副伤寒的口服疫苗奠定了初步基础。

关键词：减毒猪霍乱沙门氏菌平衡致死系统产类志贺氏毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin Escherichia coli,SLTEC)

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紫云英AD-cDNA文库构建及与豆血红蛋白Lb相互作用靶蛋白的筛选

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微生物学报 2010年第12期50卷 1607-1612页

作者：刘燕谷慧琳熊小波李一星李友国华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

【目的】本文旨在构建紫云英酵母双杂交AD-cDNA文库和互作靶蛋白筛选平台,为深入研究共生固氮作用的分子机理奠定工作基础。【方法】以接种华癸中慢生根瘤菌7653R的豆科植物紫云英不同时期根部组织为材料,抽提和纯化RNA,构建了一个酵母A... 详细信息

【目的】本文旨在构建紫云英酵母双杂交AD-cDNA文库和互作靶蛋白筛选平台,为深入研究共生固氮作用的分子机理奠定工作基础。【方法】以接种华癸中慢生根瘤菌7653R的豆科植物紫云英不同时期根部组织为材料,抽提和纯化RNA,构建了一个酵母AD-cDNA文库。库容量达到1.02×106/3μg pGADT7-RecDNA,插入片段大小1-1.5 kb左右。以紫云英豆血红蛋白基因AsB2510构建诱饵载体pGBKT7-AsB2510,利用酵母双杂交技术,筛选与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白。【结果】在含有X-gal的SD四缺培养基上筛选得到26个克隆,经过质粒抽提、PCR鉴定、回转酵母验证获得10个阳性克隆。【结论】对阳性克隆的外源片段进行了测序和同源性分析,发现一个值得深入研究的含有tify domain和Divergent CCT motif的转录调控因子。

关键词：紫云英华癸中慢生根瘤菌7653R AD-cDNA文库酵母双杂交 AsB2510 互作蛋白

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