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中国植物病理学会第十一届青年学术研讨会

作者：吴松付艳苹谢甲涛程家森姜道宏湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 农业微生物学国家重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070

菌核病是油菜等油料作物上的非常重要的病害，由于没有抗病品种，加之核盘菌气传兼土传等不利因素使得菌核病难以防治。病毒广泛存在于各种真菌中，并且近年来发现在许多病原真菌中包括核盘菌中存在弱毒相关的具有生防潜力病毒资源。研...

菌核病是油菜等油料作物上的非常重要的病害，由于没有抗病品种，加之核盘菌气传兼土传等不利因素使得菌核病难以防治。病毒广泛存在于各种真菌中，并且近年来发现在许多病原真菌中包括核盘菌中存在弱毒相关的具有生防潜力病毒资源。研究弱毒相关病毒与寄主之间的互作关系对于了解病原真菌衰退的原因及其防治将起到重要的作用。

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核盘菌线粒体病毒SsMV5基因组克隆及序列分析

核盘菌线粒体病毒SsMV5基因组克隆及序列分析

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中国植物病理学会第十一届青年学术研讨会

作者：许智勇吴松松刘立江付艳苹谢甲涛姜道宏湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 农业微生物学国家重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种宿主范围广泛的植物病原真菌,可侵染450多种植物,由其引起的菌核病是油菜、大豆等经济作物的重要病害.本课题组前期研究发现核盘菌存在多种类型的真菌病毒,如双链RNA病毒、单链RNA病毒及DNA病毒...

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种宿主范围广泛的植物病原真菌,可侵染450多种植物,由其引起的菌核病是油菜、大豆等经济作物的重要病害.本课题组前期研究发现核盘菌存在多种类型的真菌病毒,如双链RNA病毒、单链RNA病毒及DNA病毒.这些病毒的发现为探讨病毒的进化、生态及其生防策略积累了一批重要的生物资源.本研究自黑龙江大豆发病残体的菌核中分离出一株核盘菌弱毒菌株HC025.相比于野生型核盘菌菌株Ep-1PNAa367和1980,菌株HC025菌丝生长缓慢、菌落扇变、气生菌丝发达、产菌核能力及致病力显著下降.提取菌株HC025的DNA和dsRNA,电泳分析发现菌株中含有一条大约2.5kb的dsRNA片段,而不合有独立于染色体外DNA片段.采用随机引物cDNA克隆、RT-PCR、5'-RACE和3'-RACE等方法克隆获得HC025-dsRNA片段的全长cDNA序列.序列分析结果表明：HC025-dsRNA的cDNA全长为2530bp,AU含量为60.2％;采用线粒体遗传密码子,HC025-dsRNA的正义链含有一个大的开放阅读框(ORF),且该ORF编码的蛋白质序列中含有典型的RdRp(RNA-dependent RNA polymerase)结构域;dsRNA正义链两个末端序列均能折叠成稳定的茎环结构.聚类分析表明HC025-dsRNA的cDNA结构及序列均与核盘菌线粒体病毒SsMV1类似,因此,HC025-dsRNA是一种线粒体病毒的基因组,并将该病毒暂时命名为核盘菌线粒体病毒5 (Sclerotinia sclerotiorum mitovirus5,SsMV5).SsMV5与其寄主核盘菌菌株HC025的弱毒特性之间的相关性分析,目前正在进行中.

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核盘菌低毒病毒SsHV2基因组结构分析及其对寄主的影响

核盘菌低毒病毒SsHV2基因组结构分析及其对寄主的影响

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中国植物病理学会第十一届青年学术研讨会

作者：胡孜进谢甲涛程家森姜道宏付艳苹湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 农业微生物学国家重点实验室(华中农业大学) 武汉430070

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种重要的植物病原菌,英寄主范围广泛,能够引起油菜等多种作物的菌核病,给农业生产造成重大经济损失.能够侵染真菌的病毒称为真菌病毒(mycovirus),大多数真菌病毒并不引起寄主表型明显变化,但栗疫...

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种重要的植物病原菌,英寄主范围广泛,能够引起油菜等多种作物的菌核病,给农业生产造成重大经济损失.能够侵染真菌的病毒称为真菌病毒(mycovirus),大多数真菌病毒并不引起寄主表型明显变化,但栗疫菌低毒病毒1(Cryphonectria hypovirus1,CHV1)能够显著降低寄主栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的致病力.利用病毒介导弱毒力菌株在欧洲已经成功应用于板栗疫病的防治.因此,筛选并克隆引起病原菌弱毒性状的真菌病毒,可为植物病真菌病害的防治提供生物资源.本课题组在核盘菌中已发现了多种类型真菌病毒,如最近发现DNA病毒可有效防菌核病.本研究自核盘菌菌核中分离获得一株弱毒菌株SX247,发现它携带有2条dsRNA片段(dsRNA1和dsRNA2).序列克隆表明2条dsRNA片段是两种真菌病毒的基因组.其中小片段dsRNA1为先前已报道的SsDRV(Xie et a1.,2006),而dsRNA的正义链含有—RdRp 结构域,该结构域与CHV1相似性较高(23％).由于先前已在核盘菌中报道了弱毒病毒SsHV1 (Xie et al.,2011),故将新克隆的病毒暂命名为Sclerotinia sclerotiorum hypovirus 2 (SsHV2).但是,SsHV2 与CHV1在基因组结构上有显著差异.首先,SsHV2基因组全长15219bp(不合PolyA),比所有低毒病毒科的病毒基因组大;其次,与CHV1由五个核苷酸(-UAAUG-)连接2个ORF(ORFA、ORFB)的基因组结构不同,SsHV2只编码一个ORF (nt 468-14965);第三,SsHV2仅含有RdRp(nt 10111-11106)和Helicase (nt 12581-13010)两个保守结构域,而CHV1除了编码RdRp和Helicase 结构域外,还含有其它功能结构域.因此,我们初步推断SsHV2是一个与CHV1亲缘关系的新病毒.水平传播实验初步证实SsHV2可引起寄主的菌落形态改变以及生长速度减慢,并且对寄主的致病力有一定的影响.病毒SsHV2与寄主间的互作正在进行中.

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核盘菌弱毒菌株SZ-150毒力衰退机理初步探讨

核盘菌弱毒菌株SZ-150毒力衰退机理初步探讨

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中国植物病理学会第十一届青年学术研讨会

作者：王前前肖雪琼付艳苹程家森姜道宏谢甲涛湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 农业微生物学国家重点实验室(华中农业大学) 武汉430070

在自然界中,弱毒相关真菌病毒在抑制寄主群体的致病力方面发挥了重要作用,是病原真菌自然衰退的重要机制之一,同时为研究真菌致病机理提供了生物资源.本课题组前期对核盘菌弱毒菌株SZ-150的生物学特性及其所含的真菌病毒进行了详细的研...

在自然界中,弱毒相关真菌病毒在抑制寄主群体的致病力方面发挥了重要作用,是病原真菌自然衰退的重要机制之一,同时为研究真菌致病机理提供了生物资源.本课题组前期对核盘菌弱毒菌株SZ-150的生物学特性及其所含的真菌病毒进行了详细的研究,结果表明SZ-150所含有弱毒病毒SsHV1及其卫星RNA与菌株的弱毒特性相关,而且明确了卫星RNA是菌株毒力衰退的重要因子(Xie et al., 2011).但是,菌株SZ-150毒力衰退原因仍需进一步探讨.分泌草酸及形成侵染结构是核盘菌重要的致病机理之一.本研究以含有SsHv1及卫星RNA的菌株SZ-150(无致病力)、仅含有SsHV1的菌株R6(中等致病力)及不含有SsHV1及卫星RNA的R59(强致病力)为材料,分析不同菌株间的草酸分泌及侵染结构形成情况,此外观察了菌丝形态及细胞结构等,获得以下结果：(1)产酸量定性分析(核盘菌分泌的酸性物质中多数为草酸,检测在含有溴酚蓝的培养基上进行)表明,菌株R59、R6可以产生大量酸性物质,菌株SZ-150虽然可以产生酸性物质,但是产酸能力显著减弱.(2)侵染结构观察发现菌株R59、R6均可在寄主叶片上形成大量侵染结构,而菌株SZ-150菌丝仅在寄主表面蔓延,不能形成或形成少量结构简单的侵染结构.(3)菌丝顶端显微观察菌丝形态,菌株R59、R6尖端分枝正常,而菌株SZ-150菌丝顶端分枝多且稠密、菌丝出现明显的色素沉积.(4)透射电镜观察表明,相对于菌株R59和R6,菌株SZ-150细胞器受到严重破坏,线粒体等细胞器渍解,细胞壁明显增厚,细胞壁周围有类似于黑色素的不规则颗粒状物分布,且部分菌丝出现菌丝内嵌套菌丝生长的现象.菌株SZ-150所表现出来的这些异常现象可以初步解释其致病力丧失的原因：由于病-SsHV1及其卫星RNA存在,影响了菌株SZ-150的菌丝生长、侵染结构形成、草酸的产生、并导致细胞器溃解,从而最终影响了菌株的毒力.SZ-150致病性衰退相关的分子机理正在深入研究中.

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禾谷镰刀菌中microRNA的检测及对FG-miR-1的初步探究

禾谷镰刀菌中microRNA的检测及对FG-miR-1的初步探究

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中国植物病理学会第十一届青年学术研讨会

作者：曾文萍王颖付艳苹谢甲涛姜道宏程家森湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 农业微生物学国家重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病(Wheat head scab)为小麦最主要的病害之一,世界各地流行发生,近年为害日趋严重.MicroRNA(miRNA)是一类在真核生物中普遍存在的、内源性非编码小分子RNA,其可在转录后调节靶基因表达,... 详细信息

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病(Wheat head scab)为小麦最主要的病害之一,世界各地流行发生,近年为害日趋严重.MicroRNA(miRNA)是一类在真核生物中普遍存在的、内源性非编码小分子RNA,其可在转录后调节靶基因表达,在正常发育以及疾病发生过程中具有重要作用.目前有关植物病原真菌中miRNA研究也日益增多,而且最近研究表明miRNA在植物病原真菌的致病过程中也发挥重要作用.本研究以产孢前后及致病过程的禾谷镰刀菌为材料,采用高通量测序技术进行了small RNA(10～34 nt)行测序,并将测序得到的small RNA 比对Genbank、Rfam(10.1)、miRBase19等数据库从而进行分类注释.此外,通过将一定长度sRNA 比对禾谷镰刀菌基因组序列,并结合其侧翼序列的二级结构分析,最终预测出28个可能的miRNA 或milRNA,这些序列长度分布具有两个高峰(21nt与24nt),在5'末端无明显碱基偏好.我们同时应用RT-PCR及Northern blot技术对部分miRNA进行了验证,检测到了部分预测miRNA的前体及成熟体结构,目前我们还采用分割标记法对FG-miR-1及可能参与miRNA加工合成的基因DCL1、DCL2进行了敲除,获得了相关基因的敲除转化子.这些敲除转化子的表型分析及相关miRNA在禾谷镰刀菌中的功能及其作用机制等正在深入研究中.

关键词：禾谷镰刀菌 MicroRNA 基因敲除

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芋花叶病毒的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

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园艺学报 2012年第3期39卷 509-515页

作者：施世明王国平徐文兴王利平洪霓华中农业大学植物科技学院湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

采用RT-PCR技术对采自中国湖北、浙江和山东的91份芋[Colocasia esculenta（L.）Schott]样品的芋花叶病毒（Dasheen mosaicvirus,DsMV）进行了检测,检出率为26.4%。对其中14个DsMV分离物的317bp扩增产物（为外壳蛋白基因的一部分）序列... 详细信息

采用RT-PCR技术对采自中国湖北、浙江和山东的91份芋[Colocasia esculenta（L.）Schott]样品的芋花叶病毒（Dasheen mosaicvirus,DsMV）进行了检测,检出率为26.4%。对其中14个DsMV分离物的317bp扩增产物（为外壳蛋白基因的一部分）序列分析的结果显示,各分离物内的核苷酸变异相对较低,而分离物间存在较大的分子变异,相似性为68.3%~97.8%。对来自湖北和浙江的2个DsMV分离物DsMV-SCS和DsMV-JH的外壳蛋白基因（coatproteingene,cp）进行了测序,全长分别为951bp和987bp,二者cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为79.0%和82.3%,与已报道DsMV的cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为73.0%~92.1%和74.8%~98.2%,在构建的系统发育树上聚在两个不同的簇,各DsMV分离物的系统进化关系与其寄主和地理来源无显著相关性。

关键词：芋芋花叶病毒 RT-PCR 外壳蛋白基因序列分析

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一个G蛋白偶联受体样蛋白是核盘菌致病和菌核形成所必需的

一个G蛋白偶联受体样蛋白是核盘菌致病和菌核形成所必需的

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中国植物病理学会2012年学术年会

作者：申翠翠吕学良程家森谢甲涛付艳苹姜道宏湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室/华中农业大学农业微生物学国家重点实验室/华中农业大学

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是重要植物病原真菌,该病原菌引起的菌核病是油菜和大豆等多种作物的首要病害。G蛋白偶联受体是一类含有7个跨膜α螺旋的膜蛋白受体,它能够感受外界环境中的各种刺激,并激活细胞内的一系列信号通路,最... 详细信息

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是重要植物病原真菌,该病原菌引起的菌核病是油菜和大豆等多种作物的首要病害。G蛋白偶联受体是一类含有7个跨膜α螺旋的膜蛋白受体,它能够感受外界环境中的各种刺激,并激活细胞内的一系列信号通路,最终引起细胞状态的改变。细胞信号转导在核盘菌的致病和菌核形成过程中起着重要作用,核盘菌的致病过程需要适宜的外界环境条件,其菌核的发育也受到温度、光照、pH值、活性氧(ROS)、O、CO和机械因素等多种环境因素的影响。但是这些环境因素是怎样通过受体传递到胞内以及核盘菌是如何感知ROS从而影响其自身发育和致病过程的机制尚不清楚。

关键词：核盘菌致病菌核形成

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禾谷镰刀菌小RNA相关通路基因的功能研究

禾谷镰刀菌小RNA相关通路基因的功能研究

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中国植物病理学会2012年学术年会

作者：王颖付艳苹姜道宏程家森湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室/华中农业大学农业微生物学国家重点实验室/华中农业大学

microRNA（miRNA）是由具有茎环结构的miRNA前体（pri-miRNA）或dsRNA经过一系列加工过程而产生的一种非编码小RNA,广泛存在于高等和低等生物体内,通过剪切靶标mRNA或抑制其翻译调控基因表达。Dicer切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为... 详细信息

microRNA（miRNA）是由具有茎环结构的miRNA前体（pri-miRNA）或dsRNA经过一系列加工过程而产生的一种非编码小RNA,广泛存在于高等和低等生物体内,通过剪切靶标mRNA或抑制其翻译调控基因表达。Dicer切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为小RNAs分子,Argonaute蛋白是RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核心元件。目前,研究表明miRNA在动植物的生长发育等过程中起重要的调控作用,有关上述小RNA通路相关基因在动植物以及部分真菌中的功能也有研究报道,但在禾谷镰刀菌中这些基因的功能均不明确,本文对禾谷镰刀菌中的DCL1、DCL2和AGO基因的功能进行了相关研究。首先通过RT-PCR检测了DCL1、DCL2和AGO基因在禾谷镰刀菌PH-1中的表达情况,发现这些基因在禾谷镰刀菌的生长和产孢等阶段均有表达。根据同源重组的原理构建了这3个基因的敲除载体,通过分割标记法用原生质体转化禾谷镰刀菌,经PCR验证分别得到了2个DCL2基因敲除转化子和4个AGO基因敲除转化子,但是没有获得DCL1的敲除转化子。进一步研究表明,DCL2基因敲除转化子和AGO基因敲除转化子在PDA培养基上生长时,菌落形态、菌丝形态、产孢量及孢子形态等方面与野生菌株PH-1相比均无显著差异,但生长速度均显著低于野生菌株PH-1,同时对HO等的抗逆性有所提高。上述研究结果初步表明DCL2和AGO基因对禾谷镰刀菌的生长具有一定的调控作用,有关这些基因禾谷镰刀菌中的详细功能,如在调控禾谷镰刀菌的子囊壳形成和孢子萌发等方面的作用有待于进一步研究。

关键词：核盘菌真菌病毒呼肠孤病毒科衰退特性

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拟南芥与芸薹属根肿菌早期互作阶段寄主差异基因筛选与功能验证

拟南芥与芸薹属根肿菌早期互作阶段寄主差异基因筛选与功能验证

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中国植物病理学会2012年学术年会

作者：毕凯赵莹程家森付艳苹姜道宏易先宏湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室/华中农业大学农业微生物学国家重点实验室/华中农业大学

十字花科作物根肿病是由专性活体寄生病原物芸薹属根肿菌(Plasmodiophora brassicae)引起,发病后期寄主植物的根系组织明显肿大、畸形,严重影响作物产量和品质。近年来该病在全世界范围内广泛发生,给十字花科作物生产带来极严重损失。... 详细信息

十字花科作物根肿病是由专性活体寄生病原物芸薹属根肿菌(Plasmodiophora brassicae)引起,发病后期寄主植物的根系组织明显肿大、畸形,严重影响作物产量和品质。近年来该病在全世界范围内广泛发生,给十字花科作物生产带来极严重损失。从分子水平研究、阐述寄主抗性机理,将为大田作物生产上有效防治该病提供有力理论依据。为了研究模式植物拟南芥与根肿菌早期互作过程寄主植物抗性的分子机理,我们通过高通量数字基因表达谱分析技术筛选到了一系列拟南芥响应根肿菌侵染的差异表达基因。其中,NHL(NDR1/HIN1-like)基因表达水平在24dpi、48dpi与对照相比,差异极显著(| log2Ratio |≥1.8)。NHL蛋白定位于植物的过氧化物酶体,在植物与病原物互作过程中,NHL蛋白在拟南芥先天性免疫(PTI)过程中发挥重要作用。NHL基因含有2个外显子,1个内含子。其cDNA序列全长747bp,编码248个氨基酸。WRKY22基因表达水平在24dpi、48dpi时与对照相比,差异显著(|log2Ratio |≥1.8),该基因含有3个外显子,2个内含子。其cDNA序列全长897bp,编码298个氨基酸。在拟南芥中WRKY家族有72～74个成员,WRKY结构域能特异性识别与其互作的顺式元件W-盒,W-盒中TGAC核心序列非常保守,W-盒存在于许多与植物防御反应相关的基因启动子中,介导了病原物来源的激发子诱导的转录反应。为了验证这些基因在拟南芥和根肿菌早期互作过程中的功能,我们将选取其中差异表达的基因,采用基因超量表达和基因置换策略,通过农杆菌介导的转化方法转化拟南芥,深入研究目标基因的超标达转化子和T-DNA插入突变体中根肿菌的侵染过程及其表型变化,有助于阐明目标基因在拟南芥与根肿菌互作过程中的功能。

关键词：拟南芥芸薹属根肿菌分子抗病机理

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盾壳霉甘露糖转移酶基因(CmPMT1)功能的初步分析

盾壳霉甘露糖转移酶基因(CmPMT1)功能的初步分析

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中国植物病理学会2012年学术年会

作者：赵莹程家森付艳苹姜道宏湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室/华中农业大学农业微生物学国家重点实验室/华中农业大学

盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的重要寄生真菌,自然条件下它能够寄生核盘菌属真菌,具有良好的生防潜能。糖基化是蛋白质的一种重要修饰形式,对生物体正常生长发育起到关键的作用,甘露糖转移酶基因(P... 详细信息

盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的重要寄生真菌,自然条件下它能够寄生核盘菌属真菌,具有良好的生防潜能。糖基化是蛋白质的一种重要修饰形式,对生物体正常生长发育起到关键的作用,甘露糖转移酶基因(PMTs)是调控蛋白甘露糖化的起步基因,但关于该基因的研究在真菌中主要集中于曲霉,与菌株的生长和形态等发育有关,在其他真菌中鲜有报道。盾壳霉甘露糖转移酶基因CmPMT1全长2 396bp,有4个外显子和3个内含子。该基因在盾壳霉ZS-1中于PDA培养96h表达量最高,推断该基因与盾壳霉产孢密切相关。为了进一步明确该基因在盾壳霉中的功能,利用同源重组和农杆菌介导转化的方法定点敲除了CmPMT1基因,获得了CmPMT1的敲除转化子。与出发菌株ZS-1相比,敲除转化子在PDA上菌丝多隔且不光滑,顶端分支增多;生长速度明显降低,为野生菌株ZS-1的1/3左右。产孢的早期敲除转化子与出发菌株ZS-1未出现明显差异,但敲除转化子的分生孢子不能正常分泌。利用机械压力可使敲除转化子的孢子释放,形态与出发菌株ZS-1的孢子无显著差异。利用农杆菌介导转化的方法对敲除转化子进行互补,其表型恢复正常,分生孢子器能够正常分泌孢子。研究结果初步说明盾壳霉中甘露糖转移酶基因CmPMT1与分生孢子的分泌有关,具体的调控机理仍需进一步研究。

关键词：盾壳霉产孢甘露糖转移酶基因

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