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作者

126 篇 姜道宏
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116 篇 谢甲涛
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48 篇 李国庆
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灰葡萄孢致病相关基因BC1G07326的克隆及其功能验证

灰葡萄孢致病相关基因BC1G07326的克隆及其功能验证

引用

中国植物病理学会第十届全国会员代表大会暨2014年学术年会及第四届中美植物病理学学术研讨会

作者：刘信强谢甲涛付艳苹姜道宏陈桃李国庆程家森湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 农业微生物学国家重点实验室(华中农业大学)

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是一种世界性分布的重要植物病害,灰葡萄孢的寄主范围极其广泛,能侵染400多种植物,造成严重的经济损失。灰葡萄孢对寄主的致病作用是一个极其复杂的过程,多种致病因子参与其中,例如,细胞壁... 详细信息

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是一种世界性分布的重要植物病害,灰葡萄孢的寄主范围极其广泛,能侵染400多种植物,造成严重的经济损失。灰葡萄孢对寄主的致病作用是一个极其复杂的过程,多种致病因子参与其中,例如,细胞壁降解酶、毒素、抵抗寄主防卫反应的酶类及小分子物质。灰霉病的防治是农业生产上的难题之一,从分子水平上探究灰葡萄孢的致病机制可为灰霉病的防治奠定一定的基础。本研究主要利用基因敲除和基因互补技术对灰葡萄孢基因BC1G7326的功能进行初步研究,目前主要取得以下研究结果。灰葡萄孢基因BC1G7326在致病过程中表达显著上调,该基因开放阅读框1 911bp,包含12个外显子,11个内含子,编码一种含有346个氨基酸的未知蛋白。通过SingalP4.1 server软件预测显示,位于其N端的前20个氨基酸为信号肽序列,因此,推测该蛋白可能是分泌蛋白。通过Blast分析表明,BC1G7326蛋白仅在核盘菌中发现了同源蛋白,未发现保守结构域。我们以灰葡萄孢菌株B05.10为研究材料,利用同源重组的方法对该基因进行了敲除,采用PEG介导原生质体转化技术共获得20个敲除转化子,通过PCR和Southern blot技术对部分敲除转化子进行验证,并对敲除转化子的生物学特性进行了初步研究。结果显示,与出发菌株B05.10相比,敲除转化子的生长速度、菌丝形态、菌落形态和产酸没有显著差异,致病力显著减弱。关于敲除转化子的其他生物学特性的研究正在进行当中。

关键词：灰葡萄孢致病 BC1G07326

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盾壳霉生长发育相关基因CmAvaB的功能研究

盾壳霉生长发育相关基因CmAvaB的功能研究

引用

中国植物病理学会第十届全国会员代表大会暨2014年学术年会及第四届中美植物病理学学术研讨会

作者：杨潇湘程家森谢甲涛姜道宏陈桃付艳苹湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 农业微生物学国家重点实验室(华中农业大学)

盾壳霉(Coniothyrium minitans)是植物病原菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的重寄生真菌,对核盘菌的菌核和菌丝均具有寄生与破坏作用,对核盘菌引起的作物菌核病具有明显的防治效果。研究盾壳霉产孢相关的基因及其调控机理,将有助于... 详细信息

盾壳霉(Coniothyrium minitans)是植物病原菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的重寄生真菌,对核盘菌的菌核和菌丝均具有寄生与破坏作用,对核盘菌引起的作物菌核病具有明显的防治效果。研究盾壳霉产孢相关的基因及其调控机理,将有助于提高盾壳霉的规模化生产与生防效率。本文以盾壳霉ZS-1菌株的T-DNA插入标记的生长与产孢缺陷型突变体ZS-1N22225为材料,克隆并明确了生长发育相关基因CmAvaB的功能,其结果如下:与出发菌株ZS-1相比,突变体ZS-1N22225菌丝致密、弯曲,色素减少、生长速度和产孢量均显著下降;寄生致腐菌核的能力下降约50%。通过中性红染色及电镜观察发现该突变体细胞的液泡形态发生改变,呈众多小囊泡状分布。通过Southern blot验证了突变体ZS-1N22225中TDNA是单拷贝插入,然后通过反向PCR获得了其T-DNA的侧翼序列,结合盾壳霉的全基因组序列分析,发现T-DNA插入在一个全长为3 315bp的基因的启动子区域。该基因在盾壳霉基因组中是单拷贝,包含3个外显子和2个内含子,编码一个1071aa的蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列在NCBI上进行比对,发现其与小球腔菌、小麦德氏霉和黄曲霉等真菌的AVBA蛋白的相似性分别为93%、96%和77%,属于Vam6p/Vps39p家族,具有保守的CNH和CLH结构域。因此在盾壳霉中将该基因命名为CmAvaB。通过RT-PCR验证基因CmAvaB在突变体ZS-1N22225中的表达量显著低于出发菌株ZS-1,因此在突变体ZS-1N22225中基因CmAvaB的部分功能被破坏。为了研究该基因在盾壳霉中的功能,采用了基因敲除和基因互补技术,敲除转化子的生长速度、产孢量和寄生核盘菌菌核的能力均显著低于ZS-1;而互补转化子的这些表型都得到了恢复。敲除转化子的液泡也呈众多小囊泡状分布,细胞自噬相关基因的表达量均显著低于出发菌株ZS-1,说明基因CmAvaB可能在细胞自噬过程中起着重要的作用,破坏了该基因导致细胞自噬过程受到阻碍。有意思的是在pH值较低的环境下(pH值=3～4),可以使得敲除转化子的生长及菌丝形态得到很大程度的恢复。基因CmAvaB被破坏后,几丁质分布发生变化,从而使得盾壳霉对细胞壁抑制因子的敏感性降低。在ZS-1中过表达CmAvaB,对盾壳霉的产孢及生长没有显著影响,但是会导致液泡畸形、肿大。综上研究表明CmAvaB既可以维持液泡形态和功能、参与细胞自噬过程,并在盾壳霉生长发育和产孢过程中发挥着重要的作用。

关键词：盾壳霉产孢液泡形成核盘菌菌核病

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核盘菌致病及菌核形成分子机制研究

核盘菌致病及菌核形成分子机制研究

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中国菌物学会第六届会员代表大会（2014年学术年会）暨贵州省食用菌产业发展高峰论坛

作者：吕学良周佳宏付艳苹谢甲涛姜道宏程家森湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 农业微生物学国家重点实验室(华中农业大学)

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种重要的植物病原真菌,其导致的菌核病是多种作物产量提高的主要障碍。核盘菌寄主范围广泛,病害循环复杂,目前在油菜和大豆等作物中也没有发现抗性品种,因此菌核病的控制是农业生产中的世界性难题... 详细信息

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种重要的植物病原真菌,其导致的菌核病是多种作物产量提高的主要障碍。核盘菌寄主范围广泛,病害循环复杂,目前在油菜和大豆等作物中也没有发现抗性品种,因此菌核病的控制是农业生产中的世界性难题。全面了解核盘菌的生物学特性,特别是核盘菌菌核发育和致病的分子机制,对研发新的菌核病防控技术具有重要意义。在前期研究中,我们结合数字基因表达谱和生物信息学方法从核盘菌中筛选出了在致病和菌核形成阶段特异性上调的基因。在致病机制研究方面,筛选出了314个核盘菌在致病早期(8-12h)表达显著上调的分泌蛋白,其中30个蛋白编码基因的表达上调10倍以上。利用RNAi技术沉默了其中一个分泌蛋白编码基因SFSV(Sclerotiniaceae family-specific virulent gene),该基因沉默后核盘菌致病力和菌核形成能力均有所减弱。该蛋白能诱导烟草的过敏性坏死反应,通过酵母双杂交和双分子荧光技术筛选明确了其与寄主蛋白EID1和QCR8互作。在菌核形成研究方面,我们证实了核盘菌中的肉桂醇脱氢酶编码基因Ss-CAD与菌核发育密切相关,该基因在菌核形成过程中表达上升明显,基因沉默后菌核形成缓慢,且形成的菌核数量减少,形状减小,该基因沉默后菌核形成减少与活性氧ROS产生减少密切相关,具体的机制研究目前正在进一步之中。

关键词：核盘菌致病菌核形成

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核盘菌菌株PX14中携带病毒多样性分析

核盘菌菌株PX14中携带病毒多样性分析

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中国植物病理学会第十届全国会员代表大会暨2014年学术年会及第四届中美植物病理学学术研讨会

作者：王其华程家森谢甲涛付艳苹姜道宏湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 农业微生物学国家重点实验室(华中农业大学)

病毒混合侵染现象在受真菌病毒感染的真菌中普遍存在,核盘菌中感染ssRNA病毒的菌株均是被病毒复合侵染。前期筛选获得核盘菌异常菌株PX14,该菌株产生黄色色素但不产菌核,其致病力呈现弱毒特性。提取dsRNA发现菌株PX14中至少含有7条dsRN... 详细信息

病毒混合侵染现象在受真菌病毒感染的真菌中普遍存在,核盘菌中感染ssRNA病毒的菌株均是被病毒复合侵染。前期筛选获得核盘菌异常菌株PX14,该菌株产生黄色色素但不产菌核,其致病力呈现弱毒特性。提取dsRNA发现菌株PX14中至少含有7条dsRNA条带(按片段大小分别命名为dsRNA-A,B,As,C,D,E,F)。采用常规克隆dsRNA的策略,获得了dsRNA-A的cDNA部分序列及dsRNA-B、dsRNA-D及dsRNA-F的全长cDNA序列,并对获得的序列信息进行了初步分析。DsRNA-A是核盘菌中已报道Sclerotinia sclerotiorum hypovirus 1(SsHV1)的复制体形成,而dsRNA-As是SsHV1的一个卫星RNA。dsRNA-B全长含有8 152bp,编码三个推定的开放阅读框(0RF1,ORF2,ORF3),其中ORF1含有甲基转移酶(methyltransferase),解旋酶(viral helicase),依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)保守结构域,三个结构域分别与Botrytis virus F(BVF),Botrytis virus X(BVX)和Sclerotinia sclerotiorum debilitation-associated virus(SsDRV)相应结构域有相似性;ORF2可能编码与病毒复制相关蛋白;ORF3未比对到任何保守结构域,未知其功能,但据已报道的BVF和BVX的基因结构推断ORF3可能编码病毒的外壳蛋白。多重比对及聚类分析表明dsRNA-B代表一种新的正单链RNA病毒的复制体形成,并将该病毒命名为Sclerotinia sclerotiorum ssRNA virus(SsR-V/PX14)。dsRNA-D和dsRNA-F的cDNA全长分别为1 828bp和751bp,由于dsRNA-D和dsRNA-F的5'末端序均与SsRV/PX14的5'末端序列类似,因此推测这两个dsRNA片段可能是SsRV/PX14的卫星RNA,目前正在对其作进一步的验证。由于存在于真菌中且类似于植物芜菁花叶病毒科病毒的报道现在仅限于BVF和BVX,这些类真菌病毒与典型的芜菁花叶病毒科相比,缺少运动蛋白,外壳蛋白的功能也没有进行完善的研究,而且它们的3'端是否存在芜菁花叶病毒科典型的三叶草结构,并没有进行相关验证。因此,在对这类真菌病毒的研究,将对人们更好的认识病毒的寄主适应性提供材料支持。此外,包括SsDRV,BVF,BVX以及本研究中SsRV/PX14在内的真菌病毒与植物芜菁花叶病毒科病毒的差异也将促使我们考虑命名新的病毒类型,从而更好的将这些病毒与传统的芜菁花叶病毒科病毒区分开来。目前,菌株PX14中的其他dsRNA片段正在克隆分析中。

关键词：真菌病毒核盘菌芜菁花叶病毒

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核盘菌菌株SZ-150弱毒特性与致病因子相关性初步研究

核盘菌菌株SZ-150弱毒特性与致病因子相关性初步研究

引用

中国植物病理学会第十届全国会员代表大会暨2014年学术年会及第四届中美植物病理学学术研讨会

作者：王前前肖雪琼程家森付艳苹姜道宏谢甲涛湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 农业微生物学国家重点实验室(华中农业大学)

在自然界中,存在着大量的植物病原真菌,同时也存在着一些毒力衰退的病原真菌,在这些毒力衰退的病原真菌中,往往与真菌病毒病毒的存在紧密相关。本课题组前期发现了一株核盘菌形态异常的菌株SZ-150,其对油菜及其他寄主表现出弱毒性状,随...

在自然界中,存在着大量的植物病原真菌,同时也存在着一些毒力衰退的病原真菌,在这些毒力衰退的病原真菌中,往往与真菌病毒病毒的存在紧密相关。本课题组前期发现了一株核盘菌形态异常的菌株SZ-150,其对油菜及其他寄主表现出弱毒性状,随之对其所含的真菌病毒进行了详细的研究。研究结果表明菌株SZ-150中含有三种真菌病毒,但是与其弱毒特性相关的弱毒

关键词：

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盾壳霉CmSmk1基因功能的初步研究

盾壳霉CmSmk1基因功能的初步研究

引用

中国植物病理学会第十届全国会员代表大会暨2014年学术年会及第四届中美植物病理学学术研讨会

作者：郜丽霞谢甲涛程家森姜道宏陈桃付艳苹湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 农业微生物学国家重点实验室(华中农业大学)

盾壳霉(Coniothyriumminitans)是核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)的重寄生真菌,在菌核病防治中有重要的应用前景,但国内盾壳霉孢子的商品化及其应用相比于国外还存在差距。因此,提高盾壳霉的产孢能力,促进盾壳霉的规模化生产,对19核盘... 详细信息

盾壳霉(Coniothyriumminitans)是核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)的重寄生真菌,在菌核病防治中有重要的应用前景,但国内盾壳霉孢子的商品化及其应用相比于国外还存在差距。因此,提高盾壳霉的产孢能力,促进盾壳霉的规模化生产,对19核盘菌防治有重大的意义。通过对酵母和构巢曲霉MAPK途径分析,筛选到与已知的孢子形成相关基因SMK1同源的盾壳霉基因CmSmk1。通过克隆该基因全长为1155bp,含有1个内含子,编码355个氨基酸蛋白。Realtime PCR分析CmSmk1在盾壳霉中随培养时间的延长,其表达量逐渐上调,且产孢阶段(>72h)表达量高于未产孢阶段(<72h)表达量,表明CmSmk1可能与盾壳霉产孢相关。此外,在盾壳霉菌株ZS-1和核盘菌菌株EP-1PNA367共培养条件下,CmSmk1的表达量下调,推测CmSmk1的表达可能在盾壳霉与核盘菌互作时受到抑制。为了验证CmSmk1在盾壳霉中的功能,构建了CmSmk1基因的敲除载体和互补载体,利用农杆菌介导技术现已获得多个CmSmk1的敲除转化子。敲除转化子与出发菌株ZS-1相比,生长速度并无差异,菌落为白色,不产生分生孢子,产色素能力与寄生菌核能力均降低,说明CmSmk1与盾壳霉生长无关,但影响产孢功能。CmSmk1敲除转化子过氧化氢含量显著高于出发菌株ZS-1,说明CmSmk1与盾壳霉内过氧化氢的产生相关。在敲除转化子中与有丝分裂相关基因以及黑色素形成基因的表达量均显著低于出发菌株ZS-1,说明CmSmk1可能在有丝分裂和黑色素形成过程中起重要作用。同时通过酵母双杂交验证CmSmk1蛋白不与CmHog1和CmSlt2互作,说明不参与HOG-MAPK和CWI-MAPK信号途径。

关键词：盾壳霉产孢核盘菌菌核病

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砂梨离体植株不同组织部位提取总RNA的效果分析

砂梨离体植株不同组织部位提取总RNA的效果分析

引用

中国植物病理学会第十届全国会员代表大会暨2014年学术年会及第四届中美植物病理学学术研讨会

作者：刘娟洪霓王国平王利平华中农业大学植物科学技术学院/湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室/农业微生物学国家重点实验室

砂梨离体植株中富含单宁、多糖,在提取核酸时易污染,使其降解,提取质量差。因此,本研究对砂梨离体植株不同部位材料核酸提取进行了不同方法的效果比较,旨在确定用于提取砂梨不同部位组织部位获得高质量的核酸提取效果最佳方法。以砂梨... 详细信息

砂梨离体植株中富含单宁、多糖,在提取核酸时易污染,使其降解,提取质量差。因此,本研究对砂梨离体植株不同部位材料核酸提取进行了不同方法的效果比较,旨在确定用于提取砂梨不同部位组织部位获得高质量的核酸提取效果最佳方法。以砂梨离体植株"金水2号"叶片和茎秆为材料,采用改进的CTAB、实验室建立的SDS-过柱法（专利号:ZL201010509840.2）和Trizol（Invitrogen公司）法提取样品核酸总RNA。结果表明,采用Trizol法,样品上样量超过0.1g,核酸降解;叶片样品上样量最适为0.05g左右,裂解于1mL溶液中,电泳可清楚观察到28S、18S和5S三条核糖体RNA完整带型,无DNA条带污染,OD/OD值都在1.8～2.0,无蛋白污染,质量好。提取茎秆部位样品,电泳检测无完整的核酸RNA条带,总RNA均存在不同程度的降解。采用SDS-过柱法提取总RNA,琼脂糖电泳可以看出叶片、茎尖、茎秆中部和茎基部组织材料所提取的RNA完整性都很好,没有拖尾现象,但却有较高浓度的基因组DNA污染。对比Trizol方法和SDS-过柱法,本研究采用了CTAB法提取"金水2号"叶片和茎秆的茎尖、中部和基部组织样品,最适上样量为0.05～0.1g/mL。电泳可清楚观察到28S、18S和5S三条核糖体RNA,带型完整,无可见条带的DNA污染,紫外分光光度计检测OD/OD值也均在1.8～2.0,无蛋白污染。结果表明,采用CTAB法可以有效提取其砂梨离体组织不同部位总RNA,用于病毒检测及其RNA-sequence转录组测序等后继试验研究。

关键词：砂梨 CTAB SDS-过柱法 total RNA

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盾壳霉生长发育相关基因CmAvaB的功能研究

盾壳霉生长发育相关基因CmAvaB的功能研究

引用

中国植物病理学会2014年学术年会

作者：杨潇湘程家森谢甲涛姜道宏陈桃付艳苹湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 农业微生物学国家重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070

盾壳霉(Coniothyrium minitans)是植物病原菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的重寄生真菌，对核盘菌的菌核和菌丝均具有寄生与破坏作用，对核盘菌引起的作物菌核病具有明显的防治效果。研究盾壳霉产孢相关的基因及其调控机理，将有... 详细信息

盾壳霉(Coniothyrium minitans)是植物病原菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的重寄生真菌，对核盘菌的菌核和菌丝均具有寄生与破坏作用，对核盘菌引起的作物菌核病具有明显的防治效果。研究盾壳霉产孢相关的基因及其调控机理，将有助于提高盾壳霉的规模化生产与生防效率。本文以盾壳霉ZS-1菌株的T-DNA插入标记的生长与产孢缺陷型突变体ZS-1 N22225为材料，克隆并明确了生长发育相关基因CmAvaB的功能，其结果如下：

关键词：盾壳霉产孢液泡形成核盘菌菌核病

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禾谷镰刀菌中microRNA的检测及其通路相关基因的功能研究

禾谷镰刀菌中microRNA的检测及其通路相关基因的功能研究

引用

中国植物病理学会2014年学术年会

作者：曾文萍王颖付艳苹谢甲涛姜道宏陈桃程家森湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070 农业微生物学国家重点实验室/华中农业大学武汉430070 湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室(华中农业大学) 武汉430070

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病(Wheat head scab)为小麦最主要的病害之一,世界各地流行发生,近年为害日趋严重.MicroRNA (miRNA)是一类在真核生物中普遍存在的、内源性非编码小分子RNA,其可在转录后调节靶基因表达... 详细信息

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病(Wheat head scab)为小麦最主要的病害之一,世界各地流行发生,近年为害日趋严重.MicroRNA (miRNA)是一类在真核生物中普遍存在的、内源性非编码小分子RNA,其可在转录后调节靶基因表达,在正常发育以及疾病发生过程中具有重要作用.目前有关植物病原真菌中miRNA研究也日益增多,而且最近研究表明miRNA在植物病原真菌的致病过程中也发挥重要作用.

关键词：禾谷镰刀菌 MicroRNA 基因敲除

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砂梨离体植株不同组织部位提取总RNA的效果分析

砂梨离体植株不同组织部位提取总RNA的效果分析

引用

中国植物病理学会2014年学术年会

作者：刘娟洪霓王国平王利平华中农业大学植物科学技术学院/湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室/农业微生物学国家重点实验室武汉430070

砂梨离体植株中富含单宁、多糖,在提取核酸时易污染,使其降解,提取质量差.因此,本研究对砂梨离体植株不同部位材料核酸提取进行了不同方法的效果比较,旨在确定用于提取砂梨不同部位组织部位获得高质量的核酸提取效果最佳方法.以砂梨离... 详细信息

砂梨离体植株中富含单宁、多糖,在提取核酸时易污染,使其降解,提取质量差.因此,本研究对砂梨离体植株不同部位材料核酸提取进行了不同方法的效果比较,旨在确定用于提取砂梨不同部位组织部位获得高质量的核酸提取效果最佳方法.以砂梨离体植株"金水2号"叶片和茎秆为材料,采用改进的CTAB、实验室建立的SDS-过柱法(专利号：ZL2010 10509840.2)和Trizol(Invitrogen公司)法提取样品核酸总RNA.结果表明,采用Trizol法,样品上样量超过0.1g,核酸降解;叶片样品上样量最适为0.05g左右,裂解于1mL溶液中,电泳可清楚观察到28S、18S和5S三条核糖体RNA完整带型,无DNA条带污染,OD260/OD280值都在1.8 ～2.0,无蛋白污染,质量好.提取茎秆部位样品,电泳检测无完整的核酸RNA条带,总RNA均存在不同程度的降解.采用SDS-过柱法提取总RNA,琼脂糖电泳可以看出叶片、茎尖、茎秆中部和茎基部组织材料所提取的RNA完整性都很好,没有拖尾现象,但却有较高浓度的基因组DNA污染.对比Trizol方法和SDS-过柱法,本研究采用了CTAB法提取"金水2号"叶片和茎秆的茎尖、中部和基部组织样品,最适上样量为0.05 ～0.1g/mL.电泳可清楚观察到28S、18S和5S三条核糖体RNA,带型完整,无可见条带的DNA污染,紫外分光光度计检测OD260/OD280值也均在1.8 ～2.0,无蛋白污染.结果表明,采用CTAB法可以有效提取其砂梨离体组织不同部位总RNA,用于病毒检测及其RNA-sequence转录组测序等后继试验研究.

关键词：砂梨 CTAB SDS-过柱法 total RNA

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