检索结果-内蒙古大学图书馆

利用sacB基因反向筛选法构建GFP分别融合于猪链球菌MapZ及PBP1b蛋白的融合菌株

中国预防兽医学报 2022年第11期44卷 1149-1155页

作者：卫东陈平高广娟朱金鲁武柳君刘思国张跃灵中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为在猪链球菌(***)中引入高效的反向筛选标记,本研究根据***密码子偏好性优化了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖果聚糖酶基因sacB的密码子,并由公司合成后作为模板,采用PCR扩增sacB基因片段;采用PCR从相应模板中分别扩增***中的启... 详细信息

为在猪链球菌(***)中引入高效的反向筛选标记,本研究根据***密码子偏好性优化了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖果聚糖酶基因sacB的密码子,并由公司合成后作为模板,采用PCR扩增sacB基因片段;采用PCR从相应模板中分别扩增***中的启动子序列(Peno)及含壮观霉素抗性基因(spc)的片段;再经重叠延伸PCR扩增融合基因片段Peno-sacB-spc(PSS)。以相应模板及引物分别经PCR扩增*** mapZ基因待融合位点上下游序列UP1和DN1及其pbp1b基因待融合位点上下游序列UP2和DN2、含正/反向筛选标记的片段PSS1和PSS2基因片段,以及用于替换PSS片段的绿色荧光蛋白(GFP)gfp1和gfp2基因片段;再分别通过重叠延伸PCR扩增构建中间菌株的融合片段UP1-PSS1-DN1、UP2-PSS2-DN2以及构建GFP融合菌株的融合片段UP1-GFP1-DN1、UP2-GFP2-DN2。采用同源重组的方法将UP1-PSS1-DN1和UP2-PSS2-DN2分别转化*** 05ZYH33菌株,经壮观霉素筛选引入PSS的中间菌株。PCR及测序鉴定结果表明获得了引入PSS片段的中间菌株PSS-mapZ和PSS-pbp1b。将WT、PSS-mapZ和PSS-pbp1b分别培养于含不同浓度蔗糖(10%、7.5%、5%和2.5%)的TSAS平板上,确定WT生长而PSS-mapZ和PSS-pbp1b中间菌株不生长的蔗糖浓度(用于筛选及构建GFP融合菌株)。通过比较分析最终确定反向筛选GFP融合菌株的最适蔗糖浓度约为7%。通过同源重组的方法分别将UP1-GFP1-DN1片段转化PSS-mapZ菌株、UP2-GFP2-DN2片段转化PSS-pbp1b菌株,分别经含7%蔗糖(生长)及含壮观霉素(不生长)的TSAS平板筛选。随机选择经筛选获得的100个单菌落计算筛选的阳性率。各取6个单菌落经PCR及测序鉴定。结果显示,筛选菌株的阳性率在52%~75%。PCR及测序结果显示,获得的两种重组菌株中的gfp基因片段确实分别替换了PSS-mapZ和PSS-pbp1b中的相应PSS,表明正确构建了融合GFP的重组菌株GFP-mapZ和GFPpbp1b。本研究首次构建了高效的正/反向筛选标记PSS,以及无痕的*** GFP-mapZ和GFP-pbp1b融合菌株,为快速无痕的***遗传操作及深入研究***相关分子机制奠定了基础。

关键词：猪链球菌无痕突变 sacB基因反向筛选标记

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宿主蛋白核仁素与病毒基因组相互作用对牛肠道病毒复制影响的研究

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中国预防兽医学报 2022年第6期44卷 598-605页

作者：魏丹丹孙超常继涛于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病创新团队黑龙江哈尔滨1550069

为了探究宿主蛋白核仁素(NCL)对牛肠道病毒(BEV)复制的影响及其作用机制,本研究将构建的重组质粒pHA-NCL和NCL shRNA分别转染BHK-21细胞,采用western blot检测细胞中NCL的表达。结果显示,NCL在BHK-21细胞中分别获得了过表达和下调表达... 详细信息

为了探究宿主蛋白核仁素(NCL)对牛肠道病毒(BEV)复制的影响及其作用机制,本研究将构建的重组质粒pHA-NCL和NCL shRNA分别转染BHK-21细胞,采用western blot检测细胞中NCL的表达。结果显示,NCL在BHK-21细胞中分别获得了过表达和下调表达。在此基础上,将BEV以MOI 1感染上述过表达和下调NCL表达的BHK-21细胞,于感染8 h、10 h和12 h时收集上清液和细胞,采用qPCR、western blot(检细胞)分别检测病毒基因组RNA的复制水平、BEV结构蛋白VP1表达水平及通过上清液检测病毒滴度的变化。结果表明,过表达NCL明显促进BEV在BHK-21细胞中的复制,而下调NCL的表达则明显抑制BEV的复制。利用兔源NCL特异性抗体及同源IgG对感染BEV的BHK-21细胞进行RNA免疫共沉淀试验,并利用RT-PCR检测免疫复合物中BEV相应基因片段。结果显示,免疫复合物NCL抗体-NCL蛋白-病毒RNA免疫复合物中扩增出BEV目的基因片段,而IgG抗体对照组未扩增出任何条带,表明NCL与BEV基因组RNA存在相互作用。通过激光共聚焦试验观察BEV感染BHK-21细胞后不同时间(5 h和10 h)NCL蛋白的亚细胞定位,结果显示,BEV感染细胞后使NCL由核仁迁移至细胞质,并与病毒基因组在细胞质中共定位。利用同源重组试剂盒将线性化的pmirGLO及扩增的BEV内部核糖体进入位点(IRES)构建双荧光素酶报告质粒pmirGLO-BEV IRES,并经测序鉴定正确后分别转染NCL过表达和下调表达的BHK-21细胞,采用双荧光素酶试剂盒分别检测上述细胞中两种荧光素酶FLuc和RLuc(BEV IRES依赖性的)的活性。结果显示,与转染pHA的对照细胞相比,NCL过表达的BHK-21细胞中FLuc值无显著变化,而RLuc值显著升高(P<0.01);与转染shRNA NC的对照细胞相比,NCL表达下调的BHK-21细胞中,FLuc值无显著变化,而RLuc值显著降低(P<0.01)。表明,NCL正调控BEV IRES的翻译起始活性。本研究首次证实NCL与BEV基因组间存在相互作用,该互作可促进BEV IRES介导的病毒蛋白翻译活性,从而提高BEV的复制水平,为BEV复制的分子调控机制提供了新的见解。

关键词：牛肠道病毒核仁素内部核糖体进入位点病毒复制

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家兔ANXA1蛋白与猪瘟病毒E2蛋白相互作用并影响其复制的研究

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中国预防兽医学报 2023年第6期45卷 559-567页

作者：赵小天谢利豹张柯慧马吉飞李永锋仇华吉天津农学院动物科学与动物医学学院天津300384 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 北京五加和基因科技有限公司北京100176

本研究团队前期研究发现,猪瘟病毒(CSFV) HCLV株E2蛋白结构域Ⅰ (E2^(Domain Ⅰ))是HCLV株适应家兔的关键结构域,Domain Ⅰ中108位脯氨酸(P)和109位苏氨酸(T)是HCLV株适应家兔必需氨基酸。为进一步探究HCLV适应家兔的分子机制,本研究提... 详细信息

本研究团队前期研究发现,猪瘟病毒(CSFV) HCLV株E2蛋白结构域Ⅰ (E2^(Domain Ⅰ))是HCLV株适应家兔的关键结构域,Domain Ⅰ中108位脯氨酸(P)和109位苏氨酸(T)是HCLV株适应家兔必需氨基酸。为进一步探究HCLV适应家兔的分子机制,本研究提取家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白分别与CSFV Shimen (SM)株E2蛋白(SM E2)、HCLV株E2蛋白突变体(HCLV E2^(P108L-T109I))及HCLV株E2蛋白(HCLV E2)共孵育,经SDS-PAGE后通过蛋白质质谱鉴定,结果却意外发现,CSFV SM E2与家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白作用后在37 ku左右处多出一条带;质谱分析结果显示其可能为细胞膜蛋白膜联蛋白1 (ANXA1),且与CSFV SM E2蛋白之间可能存在相互作用。为了分析ANXA1在HCLV适应家兔中的作用,将CSFV SM株和HCLV株分别接种家兔,48 h和72 h后分离各组兔外周血单个核淋巴细胞(PBMC),采用RT-q PCR方法检测ANXA1基因m RNA的转录水平。结果显示,与对照组相比,家兔在接种SM株和HCLV株后,ANXA1基因m RNA转录水平均显著(P<0.05)或者极显著(P<0.01)下调,且与接种HCLV株的家兔相比,接种SM株家兔中ANXA1基因m RNA的转录水平极显著(P<0.001,72 h)或者显著(P<0.05,48 h)下调,表明接种SM株后的家兔可能通过调控ANXA1的转录水平抑制SM株的复制。将pCAGGS-Flag-ANXA1和pCAGGS-Flag分别转染HKE293T细胞,48 h后收集细胞样品,通过GST pulldown验证ANXA1与CSFV SM E2蛋白的相互作用;将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为强毒实验组,将pCAGGS-Myc-HCLV E2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为弱毒实验组,48 h后采用Co-IP试验验证ANXA1与不同CSFV E2的相互作用。上述结果进一步表明,ANXA1与CSFV SM E2存在相互作用,但其与HCLV E2无相互作用;将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为实验组,采用激光共聚焦显微镜观察发现SM E2蛋白和ANXA1蛋白共定位于细胞浆中。将表达ANXA1的重组质粒转染ST细胞,48 h后分别接种CSFV SM株和HCLV株,采用RT-q PCR检测CSFV基因的拷贝数。结果显示,与转染pCAGGS-Flag的ST细胞相比,接种CSFV SM株的细胞中病毒基因拷贝数极显著上升(P<0.01),而接种HCLV株细胞中病毒基因拷贝数无明显变化。表明过表达ANXA1后可以促进CSFV强毒株的复制,但不影响弱毒株的复制。本研究首次证实,家兔脾脏淋巴细胞ANXA1通过与CSFV SM E2蛋白的相互作用促进CSFV的复制,为进一步研究CSFV E2蛋白的功能奠定了基础。

关键词：猪瘟病毒 E2蛋白病毒复制适应性家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白膜联蛋白1

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结核分枝杆菌复合群、副结核分枝杆菌和禽分枝杆菌禽亚种多重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2023年第1期45卷 51-59页

作者：蔡珠明党光辉臧鑫鑫邵明珠唐阳阳鹿萍崔莹莹崔子寅刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118

结核分枝杆菌复合群(MTBC)、包括结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等;非结核分枝杆菌(NTM)中禽分枝杆菌(MA)是自然界常见的动物致病菌,包含4个亚种,分别为禽分枝杆菌禽亚种(MAA)、禽分枝杆菌人/猪亚种(M... 详细信息

结核分枝杆菌复合群(MTBC)、包括结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等;非结核分枝杆菌(NTM)中禽分枝杆菌(MA)是自然界常见的动物致病菌,包含4个亚种,分别为禽分枝杆菌禽亚种(MAA)、禽分枝杆菌人/猪亚种(MAH)、禽分枝杆菌副结核亚种/副结核分枝杆菌(MAP)和禽分枝杆菌森林土壤亚种(MAS)。为建立MTBC、MAP和MAA的多重荧光定量PCR检测方法,本研究基于MTBC、MAP和MAA的特异性基因devR、F57和IS901分别设计引物及探针,通过优化各反应条件,建立了一种可同时检测3种分枝杆菌的多重Taq Man荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对MTB、MB、MAP、MAA和MAS检测为阳性,对其他畜禽病原菌,包括MAH、13种NTM和7种非分枝杆菌检测结果均为阴性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对MB、MAP和MAA重组质粒标准品的检测限均为1.0拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,批内与批间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法检测体外模拟污染(MB、MAP和MAA菌液浓度分别为1.0×10^(3)cfu/mL~1.0×10^(0)cfu/mL)的27份牛抗凝血和12份牛淋巴结组织样品,确定该方法对3种菌的检测限,结果显示该方法对3种菌的检测限均为1.0 cfu/mL~10.0 cfu/mL。将浓度为1.0×10^(6)cfu/mL的MB、MAP和MAA菌液分别单一、两两混合、三种菌混合感染BALB/c小鼠,5 d后,剖杀各组小鼠并取各组织及血液样品,同时采用该方法、常规单一PCR及细菌分离培养方法检测,比较三者的检测结果。结果显示,多重荧光定量PCR方法对不同感染组小鼠的各组织样品检出率为98.1%(212/216),常规单一PCR方法的检出率为81.5%(176/216),细菌分离培养的检出率为52.8%(114/216),多重荧光定量PCR与常规单一PCR的阳性符合率均为100.0%(176/176),与细菌分离培养鉴定结果的阳性符合率均为100.0%(114/114)。本研究首次建立了能够同时检测MTBC、MAP和MAA的Taq Man多重荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性及稳定性好,检测性能强,可以用于临床各种样品的检测,为这3种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

关键词：结核分枝杆菌复合群副结核分枝杆菌禽分枝杆菌禽亚种多重Taq Man荧光定量PCR

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犬ANP32蛋白多态性及其对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响

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中国畜牧兽医 2022年第7期49卷 2462-2473页

作者：张媛于萌萌孙留克郭兴那雷刘荻萩姜骞张海丽王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 吉林大学动物医学学院人兽共患病研究教育部重点实验室长春130062

【目的】探索犬酸性核磷蛋白32(canis acidic(leucine-rich)nuclear phosphoprotein 32 ku,caANP32)对不同物种A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)RNA聚合酶活性的影响。【方法】利用实时荧光定量PCR方法分析caANP32家族基因(caANP32A、caANP32B及caANP32E)的组织分布并对其进行扩增和克隆,评估caANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用。【结果】caANP32家族基因在不同组织中分布相似,其中caANP32B基因组织丰度显著或极显著高于caANP32A和caANP32E基因(P<0.05;P<0.01),在心脏、盲肠和大脑中caANP32E基因组织丰度极显著或显著高于caANP32A基因(P<0.01;P<0.05),在肝脏、肺脏等组织中caANP32E与caANP32A基因丰度均无显著差异(P>0.05)。在犬心脏组织和MDCK细胞中发现,caANP32A基因仅存在1个转录本,caANP32B基因存在3个不同剪接变体:caANP32B_X1、caANP32B_X2和caANP32B_X3;caANP32E基因具有2个不同剪接变体:caANP32E_X1和caANP32E_X2。通过分析ANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响发现,caANP32A和caANP32B均能支持犬流感病毒(H3N2_(GD11))和马流感病毒(H3N8_(JL89))RNA聚合酶活性,而对禽流感病毒(H9N2_(ZJ12))RNA聚合酶活性支持较低。caANP32B_X2剪接变体对哺乳动物流感病毒RNA聚合酶活性的支持能力显著高于caANP32B_X1和caANP32B_X3(P<0.05);而caANP32E不支持A型流感病毒RNA聚合酶活性。【结论】本研究初步解析了caANP32家族蛋白的组织分布及序列多态性,阐明了其对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用,为解析MDCK细胞作为流感病毒分离和疫苗生产细胞系的分子机制提供了新的借鉴。

关键词： A型流感病毒(IAV) 犬酸性核磷蛋白32(caANP32) MDCK细胞聚合酶活性

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体外法优化玉米——杂粕型饲粮的非淀粉多糖酶谱及其对育肥猪肠道微生物的影响

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中国农业科学 2022年第16期55卷 3242-3255页

作者：邓富丽申丹钟儒清张顺芬李滔孙曙东陈亮张宏福中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室湖南友联禾邦生物技术有限公司

【目的】利用体外模拟法优化玉米—杂粕型饲粮的非淀粉多糖（NSP）酶谱，并分析优化的非淀粉多糖酶谱对饲粮养分消化率和育肥猪肠道微生物组成和结构的影响，为饲粮高效利用和精准饲养提供数据支撑和理论参考。【方法】试验一在育肥猪... 详细信息

【目的】利用体外模拟法优化玉米—杂粕型饲粮的非淀粉多糖（NSP）酶谱，并分析优化的非淀粉多糖酶谱对饲粮养分消化率和育肥猪肠道微生物组成和结构的影响，为饲粮高效利用和精准饲养提供数据支撑和理论参考。【方法】试验一在育肥猪玉米—杂粕型饲粮中分别添加不同水平的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和果胶酶6种NSP酶，采用胃—小肠体外模拟法测定体外回肠干物质消化率（IVIDMD）；取IVIDMD达到最大值时各NSP酶的添加水平为该NSP酶0编码水平，按照六元二次回归正交旋转组合设计，进行体外消化试验，建立IVIDMD与NSP酶添加量的六元二次回归方程，筛选出玉米—杂粕型饲粮最优NSP酶谱（OEC）；利用胃—小肠—大肠体外模拟消化法分析测定添加OEC前后饲粮的体外干物质消化率（IVDMD）、体外能量消化率（IVGED）和体外消化能（IVDE），以验证OEC的效果。试验二按照单因素完全随机设计，选用16头健康、体重相近去势公猪（117.8±1.66 kg），随机分为2个处理组，每个处理8头猪，对照组饲喂玉米—杂粕型基础饲粮，加酶组在基础饲粮中添加OEC；在试验开展第18天采用直肠擦拭法采集猪新鲜粪便，利用16S rRNA基因高通量测序对粪便微生物菌群的多样性及相对丰度进行分析，并进行功能预测。【结果】（1）在本试验条件下，玉米—杂粕型饲粮OEC为：纤维素酶1 003 U·kg-1、木聚糖酶18 076 U·kg-1、β-葡聚糖酶1 377 U·kg-1、β-甘露聚糖酶14 765 U·kg-1、α-半乳糖苷酶337 U·kg-1和果胶酶138 U·kg-1;（2）在玉米—杂粕型饲粮中添加OEC使IVDMD由73.44%显著提高到76.26%（P<0.01）,IVGED由74.03%显著提高到76.45%（P=0.01）,IVDE由14.97 MJ·kg-1显著提高到15.58 MJ·kg-1（P<0.01）;（3）在门水平上，共筛选出了12个相对丰度大于0.1%的菌门，其中Bacteroidota（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）和Spirochaetota（螺旋体门）为优势菌门，三者之和在组内占比达96%以上；（4）在属水平上，饲粮中添加OEC显著增加norank＿f＿F082,norank＿f＿Bacteroidales＿RF16＿group,Bacteroides（拟杆菌属）和Roseburia（氏菌属）的相对丰度（P<0.05）,Eubacterium＿ruminantium＿group（P=0.083）有增加的趋势，而Oscillibacter（颤杆菌克）的相对丰度显著降低（P<0.05）,Clostridium＿sensu＿stricto＿1和norank＿f＿＿norank＿o＿＿WCHB1-41（P=0.083）有降低的趋势（P=0.052）。【结论】饲粮中添加体外法优化的NSP酶谱，显著提高了育肥猪玉米—杂粕型饲粮干物质和能量的体外消化率以及体外消化能，增加了纤维分解菌和产丁酸菌等有益菌在育肥猪肠道微生物中的占比，在一定程度上减少了有害菌的数量，优化了肠道微生态。

关键词：非淀粉多糖酶谱体外法育肥猪养分消化肠道微生物

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Annexin蛋白家族调控病毒复制和抗病毒天然免疫反应的研究进展

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 1014-1019页

作者：薛梦迪黄丽翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队/黑龙江省兽医免疫学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和... 详细信息

病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和异物的侵袭而介导抗病毒免疫反应的第一道防线,其激活依赖于模式识别受体(Pattern-recognition receptors,PRRs)识别病原体保守的分子结构称病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),以激活下游相关信号通路,发挥抵御病原体侵入的功能。

关键词：病毒吸附模式识别受体病毒复制复制过程病原相关分子模式第一道防线病原微生物流感病毒

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不同马传染性贫血病毒株编码的S2蛋白拮抗SERINC5分子机理的研究

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中国预防兽医学报 2022年第1期44卷 1-8页

作者：李荣荣李苏楠 Iqbal Ahmad 郑永辉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室-美国密歇根州立大学天然免疫联合实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究不同马传染性贫血病毒(EIAV)编码的S2蛋白拮抗宿主限制因子丝氨酸整合蛋白5(Ser5)的机制,本研究利用HIV-1野生型(WT)和HIV-1ΔNef前病毒质粒包装两种HIV-1假病毒,通过测定细胞上清中病毒粒子含量和靶细胞中荧光素酶活性检测病毒... 详细信息

为研究不同马传染性贫血病毒(EIAV)编码的S2蛋白拮抗宿主限制因子丝氨酸整合蛋白5(Ser5)的机制,本研究利用HIV-1野生型(WT)和HIV-1ΔNef前病毒质粒包装两种HIV-1假病毒,通过测定细胞上清中病毒粒子含量和靶细胞中荧光素酶活性检测病毒相对感染性,分析pSPEIAV19编码的S2蛋白(S2)和中国EIAV弱毒疫苗编码的S2蛋白(HRB-S2)对Ser5抗病毒活性的影响,结果显示S2和HRB-S2蛋白均能拮抗宿主Ser5的抗病毒活性,且S2拮抗Ser5的能力比HRB-S2强。将表达Ser5和野生型HRB-S2及其突变体的质粒共转染293T细胞,检测HRB-S2对Ser5表达的影响,结果显示HRB-S2能显著降解Ser5蛋白,并且HRB-S2降解Ser5的关键氨基酸位点是L^(26)。将表达Ser5和野生型HRB-S2及其突变体的质粒共转染Hela细胞,通过激光共聚焦试验检测HRB-S2对细胞内Ser5定位的影响,结果显示HRB-S2将位于细胞膜表面的Ser5表达下调并内化至细胞浆内,而L^(26)突变后HRB-S2下调Ser5的能力降低。将表达Ser5、HRB-S2、AP-2、Rab7和Rab11的质粒共转染293T细胞,检测AP-2、Rab7和Rab11在HRB-S2降解Ser5中的作用,结果发现三者在HRB-S2降解Ser5中均发挥重要的作用。将与VC或者VN融合表达的Ser5、HRB-S2、S2的质粒共转染Hela细胞,检测三者在细胞内的共定位情况,结果发现HRB-S2存在二聚体,而S2则不会形成二聚体。将表达Ser5、HRB-S2、S2的质粒共转染293T细胞,转染24 h后加入不同降解通路的抑制剂,检测S2降解Ser5的不同通路,结果显示HRB-S2可以通过蛋白酶体通路和溶酶体通路降解Ser5;而S2蛋白只通过溶酶体途径降解Ser5。本研究结果首次表明不同EIAV编码的S2蛋白均能通过降解Ser5蛋白而拮抗其抗病毒活性,其中S2拮抗Ser5的能力比HRB-S2强,HRB-S2蛋白的二聚体化可能会影响其对Ser5的敏感性。本研究阐明了不同EIAV S2蛋白拮抗Ser5的差异及机制,为抗逆转录病毒如HIV-1抗病毒制剂的开发提供参考依据。

关键词：丝氨酸整合因子5 逆转录病毒 S2 HRB-S2 抗病毒活性降解通路

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鸭肠炎病毒疫苗株UL41和UL40基因间隔区作为其复制非必需区的鉴定

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 996-1000页

作者：刘静赵玉博焦晨晨陈普成胡玉珍姜永萍陈化兰柳金雄中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为探寻鸭肠炎病毒(DEV)基因组中可插入外源基因的复制非必需区,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建重组质粒pX459-ul4140和含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的穿梭片段UL41-RFP-UL40,转染后拯救重组病毒,并对其进行噬斑纯化。通过PC... 详细信息

为探寻鸭肠炎病毒(DEV)基因组中可插入外源基因的复制非必需区,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建重组质粒pX459-ul4140和含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的穿梭片段UL41-RFP-UL40,转染后拯救重组病毒,并对其进行噬斑纯化。通过PCR和荧光显微镜观察对重组病毒进行鉴定,结果显示,经拯救得到表达RFP的重组病毒rDEV-ul4140RFP;所有代次的rDEV-ul4140RFP在显微镜下均能观察到红色荧光,表明重组病毒中的RFP基因稳定存在。将rDEV-ul4140RFP和亲本病毒DEV疫苗株接种鸡胚成纤维细胞(CEFs)后,收集24 h、48 h、72 h、96 h的细胞和上清,检测TCID并绘制生长曲线。结果显示,rDEV-ul4140RFP在CEF中的生长曲线和亲本DEV疫苗株无显著差异。利用SPF鸭对rDEV-ul4140RFP的免疫保护效果进行评价。攻毒保护实验结果显示,rDEV-ul4140RFP和亲本病毒DEV疫苗株均能对SPF鸭提供100%的免疫保护。本研究结果证实DEV基因组UL41和UL40基因间隔区可作为外源基因的插入位点,为以DEV为载体构建相关重组疫苗提供参考依据。

关键词：鸭肠炎病毒 CRISPR/Cas9 复制非必需区

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自主研发生物安全型换笼工作台的性能检测与评价

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实验动物与比较医学 2022年第2期42卷 102-110页

作者：苏世博马文杰王伟郭慧娟张贺王梓康雷刘守琦刘怀然司昌德苟春天张伟陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室国家禽类实验动物资源库黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

目的对自主研发的生物安全型换笼工作台进行功能检测与安全性评价。方法依据YY 0569—2011《Ⅱ级生物安全柜》、RB/T 199—2015《实验室设备生物安全性能评价技术规范》等标准对自主研发的由深圳泓腾生物科技有限公司生产的生物安全型... 详细信息

目的对自主研发的生物安全型换笼工作台进行功能检测与安全性评价。方法依据YY 0569—2011《Ⅱ级生物安全柜》、RB/T 199—2015《实验室设备生物安全性能评价技术规范》等标准对自主研发的由深圳泓腾生物科技有限公司生产的生物安全型换笼工作台(HT-1303)的各项性能指标进行检测,并判定其有效性及安全性。结果换笼工作台的主体外观完整性和稳定性、工作区洁净度、流入气流流速、下降气流流速、照度、噪声、气流流向、高效过滤器等检测效果良好,达到Ⅱ级生物安全柜标准。污染物品回收舱及器物表面灭菌舱的气密性效果良好,其尺寸、灭菌笼盒数量等还需进一步改进。结论本团队研制的生物安全型换笼工作台可实现整机正常运行,其各项指标合格,能够完成负压环境下独立通风笼具的更换,并保证操作者、实验对象及环境的安全。

关键词：换笼工作台性能检测生物安全

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