检索结果-内蒙古大学图书馆

中国畜牧兽医 2021年第12期48卷 4628-4640页

作者：马占邦许丽文王芳芳张莉莉侯雨彤韩宗玺马得莹东北农业大学动物科学技术学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

试验旨在探讨不同来源的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)诱导SPF鸡发病的免疫机制。选用140只1日龄SPF白来航鸡,随机分为4组,3组攻毒组通过滴鼻点眼途径分别接种鸡源IBV强毒株、鸡源IBV弱毒株和野鸡源IBV毒株3个毒... 详细信息

试验旨在探讨不同来源的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)诱导SPF鸡发病的免疫机制。选用140只1日龄SPF白来航鸡,随机分为4组,3组攻毒组通过滴鼻点眼途径分别接种鸡源IBV强毒株、鸡源IBV弱毒株和野鸡源IBV毒株3个毒株,对照组以同种方式接种等量灭菌的磷酸盐缓冲液。在感染后12 h、36 h、72 h、7 d和14 d,每组随机选取5只进行剖检,并分别采集法氏囊、肾脏和气管组织,剩余鸡用于观察临床症状、发病及死亡情况。应用实时荧光定量PCR检测攻毒后不同时间点采集的各组织中IBV的病毒载量、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)及部分细胞因子(白细胞介素(interleukin,IL)和干扰素(interferon,IFN))表达量的变化。结果显示,感染不同来源IBV毒株之后仅鸡源IBV强毒株感染组SPF鸡出现抑郁、翅膀下垂、甩头等典型的临床症状,且在感染后5~10 d共有7只死亡,死亡率为20%。病理剖检发现,感染鸡源IBV强毒株的鸡肾脏肿大、尿酸盐沉积和有花斑样病变,而感染野鸡源IBV毒株、鸡源IBV弱毒株和对照组的鸡无明显的眼观病变。实时荧光定量PCR结果显示,在鸡源IBV强毒株组的法氏囊、肾脏和气管3个组织中均检测到病毒。对照组和野鸡源IBV毒株组中均未检测到病毒,鸡源IBV弱毒株组只在部分组织中检测到病毒。在感染后72 h,鸡源IBV强毒株组与其他各组相比,TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7和TLR15基因在法氏囊中的表达量均显著升高(P<0.05),IL-6和IFN-β参与更强烈的抗病毒免疫反应;在感染后7 d,鸡源IBV弱毒株组与其他各组相比,肾脏中TLR2、TLR3、TLR15、TLR21、IL-6和IL-18基因表达量均显著升高(P<0.05)。野鸡源IBV感染后36 h法氏囊组织中IFN-γ基因表达量显著上调(P<0.05)。综上所述,3个IBV毒株中仅鸡源IBV强毒感染引起SPF鸡典型临床发病症状与可视组织病变,且可提高SPF鸡组织中免疫相关因子的基因表达量。本研究结果揭示,不同来源的IBV对SPF鸡的不同致病性与其感染诱导的免疫反应不同有关。

关键词：传染性支气管炎病毒(IBV) 免疫机制 Toll样受体细胞因子

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牛溶血性曼氏杆菌白细胞毒素、脂蛋白E和外膜蛋白A的免疫原性研究

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中国预防兽医学报 2021年第7期43卷 753-758页

作者：李奕欣姜志刚于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

在应激条件下,溶血性曼氏杆菌(Mh)能够引起牛的纤维素性肺炎或胸膜肺炎,对全球养牛业危害严重,免疫接种是防控Mh病的主要手段。为了评价牛源A1型Mh脂蛋白E(PlpE)、外膜蛋白A(OmpA)以及白细胞毒素(LKT)的免疫原性,本研究分别将PlpE、Omp... 详细信息

在应激条件下,溶血性曼氏杆菌(Mh)能够引起牛的纤维素性肺炎或胸膜肺炎,对全球养牛业危害严重,免疫接种是防控Mh病的主要手段。为了评价牛源A1型Mh脂蛋白E(PlpE)、外膜蛋白A(OmpA)以及白细胞毒素(LKT)的免疫原性,本研究分别将PlpE、OmpA以及LKT的毒力效应蛋白LKTA的编码基因克隆至原核表达载体pET-28a,并在大肠杆菌中表达,采用亲和层析或电洗脱的方法对重组蛋白进行提纯。将纯化的重组蛋白rPlpE、r OmpA和rLKTA分别或组合接种BALB/c小鼠,首次免疫14 d后采用相同方法加强免疫,分别于首次免疫后14 d、21 d、28 d和35 d采集小鼠血清。采用间接ELISA方法检测小鼠血清中针对Mh的特异性IgG抗体水平,结果显示各重组蛋白均能够诱导小鼠产生针对Mh的特异性IgG抗体,而rPlpE和rLKTA诱导的抗体水平明显高于r OmpA。采用牛淋巴细胞中和试验检测rLKTA免疫小鼠血清中针对LKT的中和抗体水平,结果显示rLKTA能够诱导小鼠产生高水平的中和抗体,二免后21 d小鼠血清中的平均中和抗体滴度可达363。以致死剂量的A1型Mh菌液对免疫小鼠进行攻击,结果显示rPlpE对小鼠的保护率为50%(2/4),而rOmpA对小鼠无保护作用。综上所述,r LKTA和r PlpE能够诱导小鼠产生针对Mh的保护性免疫应答,是A1型Mh的优势保护性免疫原组分,本研究为全面了解牛源A1型Mh主要免疫保护性抗原以及Mh新型疫苗的研究奠定了实验基础。

关键词：牛溶血性曼氏杆菌白细胞毒素脂蛋白E 外膜蛋白A 免疫原性

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H5亚型不同分支禽流感病毒HA基因混编文库的构建

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中国预防兽医学报 2021年第12期43卷 1245-1251页

作者：焦晨晨王波赵玉博丁蕾蕾刘静陈普成姜永萍陈化兰柳金雄中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为探究DNA Shuffling能否用于H5亚型不同分支禽流感病毒(AIV)HA基因混编文库的建立,以及利用该基因文库构建重组牛痘病毒文库的可行性,本研究构建了包含H5亚型AIV 2.3.4.4分支代表株A/Chicken/Guizhou/S4184/2017(H5N6)(简称GZ/S4184)和... 详细信息

为探究DNA Shuffling能否用于H5亚型不同分支禽流感病毒(AIV)HA基因混编文库的建立,以及利用该基因文库构建重组牛痘病毒文库的可行性,本研究构建了包含H5亚型AIV 2.3.4.4分支代表株A/Chicken/Guizhou/S4184/2017(H5N6)(简称GZ/S4184)和2.3.2.1d分支代表株A/Chicken/Liaoning/SD007/2017(H5N1)(简称LN/SD007)HA基因的重组质粒pRB-GZ/S4184HA和pRB-LN/SD007HA,并经PCR鉴定正确后分别作为模板经PCR扩增两种病毒的HA基因,并利用DNaseⅠ消化后,选择两种病毒10 bp~50 bp的HA基因等质量混合后作为模板,经Shuffling PCR混编后,选取弥散条带大量集中在2000 bp左右的Shuffling PCR产物为模板经特异性PCR扩增两种AIV的混编HA(mHA)基因。结果显示,获得2000 bp左右的mHA基因,且与从上述两种重组质粒扩增的HA基因片段大小基本一致。将mHA基因克隆至pRB21质粒中,构建pRB21-mHA质粒文库,并经PCR鉴定和测序分析其多样性。结果显示,随机挑选200个菌落检测pRB21-mHA质粒文库的阳性率为92.5%,且均呈现2种亲本病毒HA基因的碱基特性且均不相同,表明构建了HA基因序列呈现多样性的pRB21-mHA质粒文库。利用pRB21-mHA质粒文库转染预先感染缺陷牛痘病毒(rdVV-ΔVP37)的CV-1细胞,构建重组牛痘病毒(rVV-mHA)库,并分别经PCR、测序和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。结果显示,随机挑选的200个病毒噬斑,检测重组牛痘病毒库rVV-mHA的阳性率为96%;且其mHA基因编码的氨基酸序列均呈现出2种亲本病毒HA基因的氨基酸序列特性且均不相同;IFA鉴定结果显示,mHA基因均能够通过重组牛痘病毒在细胞中正确表达。以上结果表明,利用Shuffling PCR技术获得了同时呈现H5亚型AIV GZ/S4184和LN/SD007株HA基因特性的pRB21-mHA质粒文库和rVV-mHA库。本研究首次基于H5亚型不同分支AIV的HA基因,利用DNA Shuffling技术建立了Shuffling PCR方法用于构建AIV的mHA基因文库,并利用该基因文库构建重组牛痘病毒文库,为后续相关研究奠定了物质和技术基础。

关键词：禽流感病毒不同分支病毒血凝素 Shuffling PCR

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宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白相互作用的研究

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中国预防兽医学报 2021年第1期43卷 1-6页

作者：温霞赵玉辉李奇兵王倩孔凡迪梁立滨王广文李俊平姜丽陈化兰李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

核蛋白(NP)是流感病毒的主要结构蛋白,其与RNA依赖性的聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)及vRNA构成核糖核蛋白复合体,参与流感病毒复制过程中的多个阶段。宿主因子着丝粒蛋白V(CENPV)在细胞生命周期中发挥重要作用,但是目前尚未见关于CENPV蛋... 详细信息

核蛋白(NP)是流感病毒的主要结构蛋白,其与RNA依赖性的聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)及vRNA构成核糖核蛋白复合体,参与流感病毒复制过程中的多个阶段。宿主因子着丝粒蛋白V(CENPV)在细胞生命周期中发挥重要作用,但是目前尚未见关于CENPV蛋白与流感病毒NP蛋白相互作用的报道。为研究宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白相互作用机制,本实验利用酵母双杂交技术筛选与NP蛋白相互作用的CENPV,利用酵母回交验证,结果显示CENPV与NP诱饵质粒共同转化Y2H酵母感受态细胞,在DDO、QDO和QDO/X/A 3种营养缺陷型的培养基上均能生长,并使菌落呈现蓝色,与阳性对照结果一致,而阴性对照组在QDO和QDO/X/A培养基上均未观察到菌落,表明在酵母系统中宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白存在相互作用。将pCAGGS-CENPV-Myc(1μg)表达质粒与pCAGGS-NP(1μg)质粒共转染293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)检测,结果显示鼠抗NP MAb仅可结合CENPV与NP共转染组中的CENPV,表明宿主蛋白因子CENPV与流感病毒的NP蛋白存在相互作用;进一步利用激光共聚焦试验检测,结果显示在A549细胞中宿主因子CENPV与流感病毒的NP蛋白存在共定位。根据人CENPV序列设计合成CENPV的特异性siRNA,利用RNAiMAX将CENPV siRNA转染A549细胞,48 h后进行细胞活力测定和病毒感染试验,结果显示利用siRNA干扰技术下调CENPV表达后对细胞活力无影响,但可促进流感病毒在A549细胞中的复制。以上研究结果首次证实宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白存在相互作用,并且调控流感病毒的复制。本研究进一步完善了流感病毒NP蛋白与宿主因子的相互作用网络,为宿主因子调控流感病毒复制研究提供参考。

关键词：酵母双杂交流感病毒核蛋白着丝粒蛋白V 相互作用

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一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性分析

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中国预防兽医学报 2021年第8期43卷 801-805,811页

作者：李明慧田井满白晓利刘丽娜李雁冰陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

2019年11月本实验室从家禽监测样品中分离鉴定到一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/chicken/Hebei/S1/2019(H5N6)(简称CK/HeB/S1/19)。为进一步了解其生物学特点,本实验对其全基因组测序并进行遗传演化分析,结果显示,该病毒... 详细信息

2019年11月本实验室从家禽监测样品中分离鉴定到一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/chicken/Hebei/S1/2019(H5N6)(简称CK/HeB/S1/19)。为进一步了解其生物学特点,本实验对其全基因组测序并进行遗传演化分析,结果显示,该病毒属于2.3.4.4h分支,碱性裂解位点为PLRESR↓GLF,属于低致病性AIV(LPAIV)。对其各基因节段分别经BLAST比对后发现,其外部基因来源于H5N6亚型AIV,内部基因完全来源于H9N2亚型AIV,推测该分离株为一株重组病毒。将CK/HeB/S1/19病毒株接种SPF鸡及BALB/c小鼠研究其致病性,结果显示,该病毒虽然能够感染鸡,但不能在鸡体内有效复制,而该病毒未经适应就可在3只小鼠的鼻甲和肺中进行复制,对小鼠呈低致病性。本研究为H5亚型AIV的检测和其感染的综合防控提供了参考依据。

关键词：禽流感病毒低致病性 H5N6 进化分析致病性

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猪德尔塔冠状病毒S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中国动物传染病学报 2021年第3期29卷 64-70页

作者：范前进刘秋歌石达王潇博张家林汤荣锋陈建飞冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪消化道传染病创新团队哈尔滨150069

为制备猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)S蛋白的单克隆抗体,本研究首先优化、合成了PDCoV NH株的S基因,利用PCR方法从中扩增S基因片段,克隆至pAAV-IRES-hrGFP真核表达载体,构建真核表达质粒pAAV-NH-S-Flag,转染至HEK293T细胞中进行表达。采用EZv... 详细信息

为制备猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)S蛋白的单克隆抗体,本研究首先优化、合成了PDCoV NH株的S基因,利用PCR方法从中扩增S基因片段,克隆至pAAV-IRES-hrGFP真核表达载体,构建真核表达质粒pAAV-NH-S-Flag,转染至HEK293T细胞中进行表达。采用EZview Red ANTI-FLAG M2亲和凝胶蛋白纯化试剂盒进行纯化重组蛋白。将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,利用Western blot和IFA鉴定单克隆抗体的特异性。结果显示:筛选获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株17C7和23F3,单克隆抗体的亚型均为IgM,腹水效价均为1∶6400;两株单克隆抗体都与S蛋白有良好的反应性,且能够与PDCoV发生特异性反应,而与其他常见的猪腹泻冠状病毒不发生反应。本研究为PDCoV诊断及病毒入侵、感染机制的研究奠定了基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 S蛋白真核表达单克隆抗体

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提高表达分选酶A的猪链球菌突变株的构建及初步评价

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中国预防兽医学报 2021年第1期43卷 7-13页

作者：朱金鲁陈平黄萌萌刘冉卫东刘思国张跃灵中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了提高猪链球菌(Streptococcus suis,SS)05ZYH33菌株中分选酶A(SrtA)的表达量,本研究利用同源重组技术,将强启动子Peno、SrtA基因与红霉素抗性基因融合并转化05ZYH33野生菌株(05ZYH33-WT),构建SS SrtA提高表达的突变株05ZYH33-srtAe,并对05ZYH33-srtAe突变株和05ZYH33-WT进行生长特性分析和SrtA蛋白的western blot检测;进一步构建SS SrtA基因缺失株05ZYH33-srtA^(Δ)作为对照,通过检测05ZYH33-WT、05ZYH33-srtAe和05ZYH33-srtAΔ菌株表面蛋白SSU05_0630的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)的活性,初步评价SrtA的提高表达在SS表面蛋白锚定中的作用。Western blot结果显示,正确构建了SS SrtA提高表达的突变株05ZYH33-srtAe,且该菌株的生长速度和05ZYH33-WT基本相同,但SrtA的表达量却提高了2.4倍。菌株表面蛋白SSU05_0630的NAG活性检测结果显示,05ZYH33-srtA^(Δ)菌株的NAG活性和本实验室前期构建的SSU05_0630基因缺失株ssu05_0630^(Δ)相同,检测不到SSU05_0630蛋白的NAG活性,表明SSU05_0630蛋白是SrtA的底物,通过SrtA锚定到SS的表面。05ZYH33-srtAe和05ZYH33-WT菌株表面蛋白SSU05_0630的NAG活性无明显差异,即SrtA表达量的提高并没有提高SSU05_0630蛋白在SS表面的锚定量。本研究首次构建了提高SS SrtA表达量的突变株,并对SrtA表达量的提高是否对SS表面蛋白锚定产生影响进行了初步探究,为进一步研究SrtA表达量的提高对SS其他表面蛋白锚定量的影响,以及优化SS表面蛋白展示系统奠定了基础。

关键词：猪链球菌分选酶A 提高表达强启动子胞壁锚定细菌表面展示

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DHV-Ⅰ和DEV双重荧光定量PCR方法的建立

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中国兽医科学 2021年第2期51卷 169-175页

作者：陈肖韩刘海燕苏世博赵丽丽陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为建立快速特异的能够鉴别诊断DHV-I和DEV的荧光定量PCR方法,根据NCBI中I型鸭肝炎病毒和鸭肠炎病毒的保守序列,采用Beacon Designer 7.5软件,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。接着,对反应条件进行优化,验证其... 详细信息

为建立快速特异的能够鉴别诊断DHV-I和DEV的荧光定量PCR方法,根据NCBI中I型鸭肝炎病毒和鸭肠炎病毒的保守序列,采用Beacon Designer 7.5软件,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。接着,对反应条件进行优化,验证其特异性及敏感性。结果,该方法特异性好,对鹅细小病毒、番鸭细小病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、鸭坦布苏病毒、禽网状内皮增生病毒、禽呼肠弧病毒、减蛋综合征病毒、鸭甲肝病毒3型9种病毒检测,均无荧光信号。而且其灵敏度高,对DHV-I和DEV的最小检出量均为200拷贝。利用所建立的荧光定量PCR方法对江苏徐州采集的166份肛拭子进行检测,检出I型鸭肝炎病毒13份(阳性率为7.8%),鸭肠炎病毒75份(阳性率为45%)。上述结果表明,本研究建立了灵敏度高特异性强的DHV-I和DEV双重荧光定量PCR方法。

关键词： Ⅰ型鸭肝炎病毒鸭肠炎病毒,双重荧光定量

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鸡白痢沙门氏菌PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2021年第11期43卷 1178-1183页

作者：陆瑶丁仕豪曹俊刘思国于申业中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立鸡白痢沙门氏菌(***)的快速PCR检测方法,本研究通过比对*** ATCC 9120株和其他14株常见沙门氏菌及部分禽大肠杆菌的全基因组序列,在*** ATCC 9120株SEEP 011400~SEEP011405处缺失一段约10 kb碱基的区域,在此区域的侧翼序列设计并... 详细信息

为建立鸡白痢沙门氏菌(***)的快速PCR检测方法,本研究通过比对*** ATCC 9120株和其他14株常见沙门氏菌及部分禽大肠杆菌的全基因组序列,在*** ATCC 9120株SEEP 011400~SEEP011405处缺失一段约10 kb碱基的区域,在此区域的侧翼序列设计并筛选了一对特异性引物,经反应条件的优化,建立了一种能够直接从鸡蛋样品中特异性检测***的PCR方法。并对该方法检测模拟鸡蛋样品的敏感性进行了评价,结果显示:该方法可以针对***特异性的扩增出576 bp的条带,而对其他常见致病性沙门氏菌血清型(31株)和非沙门氏菌(11株)均无扩增条带。该方法对***菌液检测的敏感性为10^(2)cfu/mL,利用本研究建立的方法直接检测污染***的鸡蛋样品时的最低检测限为10^(4)cfu/mL,且只需增菌8 h后,即可检测到10^(2)cfu/mL的***。利用该方法与其他PCR方法对模拟鸡蛋样品进行检测,对比检测结果,结果显示该方法敏感性为10^(4)cfu/mL,高于其他PCR方法。利用该方法对229份临床样品进行检测,结果显示阳性检出率为3.06%(7/229),与其他检测方法结果相符。本研究建立的***鉴别检测方法具有较高的特异性与敏感性,并且能够快速检测出鸡蛋中的***,为***的检测提供了一种快速、有效的方法。

关键词：鸡白痢沙门氏菌 PCR 快速检测

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基于病毒载体的非洲猪瘟疫苗研究进展及展望

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中国预防兽医学报 2022年第8期44卷 903-909页

作者：张新王秋霞李文霞袁梦淇赵小天杨晓柯刘兴友李永锋仇华吉河南科技学院动物科技学院河南新乡453003 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 新乡学院河南新乡453003 天津农学院动物科学与动物医学学院天津300384

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由ASF病毒(ASFV)感染引起的一种急性、高度传染性、致死性动物传染病[1],临床上以高热、皮肤发绀和脏器广泛性出血为主要特征[2]。世界动物卫生组织(WOAH)将ASF列为法定报告动物疫病,我国将其列为... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由ASF病毒(ASFV)感染引起的一种急性、高度传染性、致死性动物传染病[1],临床上以高热、皮肤发绀和脏器广泛性出血为主要特征[2]。世界动物卫生组织(WOAH)将ASF列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病[3]。ASFV可感染所有品种和年龄的家猪和野猪,持续感染的野猪和软蜱是家猪感染ASFV的重要传染源。

关键词：高度传染性世界动物卫生组织动物传染病一类动物疫病猪瘟疫苗非洲猪瘟法定报告软蜱

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