检索结果-内蒙古大学图书馆

基于人ANP32A蛋白的C型流感病毒聚合酶纯化及PB2蛋白单克隆抗体的高效制备

生物工程学报 2022年第8期38卷 3041-3048页

作者：屈玉杏郭兴韩佳岐张振宇王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室马传染病与慢病毒病创新团队黑龙江哈尔滨150069

C型流感病毒是感染人的重要呼吸道病原,也可感染猪、狗等动物。聚合酶是C型流感病毒复制的核心,是研究病毒复制机制的重要靶标。然而目前没有商品化针对C型流感病毒聚合酶的单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb),一定程度制约了相关研... 详细信息

C型流感病毒是感染人的重要呼吸道病原,也可感染猪、狗等动物。聚合酶是C型流感病毒复制的核心,是研究病毒复制机制的重要靶标。然而目前没有商品化针对C型流感病毒聚合酶的单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb),一定程度制约了相关研究的开展。为了制备C型流感病毒碱性聚合酶2(polymerase basic protein 2,PB2)的MAb,本研究依据人酸性核磷酸蛋白32A(human acidic nuclear phosphoprotein 32 family member A,huANP32A)与流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)相互作用的特性,利用免疫共沉淀技术在真核表达系统中通过融合Flag标签的huANP32A(huANP32A-Flag)纯化并富集C型流感病毒RdRp(PB1、PB2、P3),并以之作为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA与Western blotting方法筛选出6株(7B11-5、8A4-5、13D9-6、8D4-1、8D4-3、9F9-4)能稳定分泌识别PB2 MAb的阳性杂交瘤细胞株。经鉴定7B11-5、8A4-5、8D4-1和8D4-3抗体亚型为IgG1型,13D9-6抗体亚型为IgG2a型,9F9-4抗体亚型为IgG3,轻链均为κ链。进一步选取1株效价高的杂交瘤细胞8D4-1来制备腹水,测定收集的小鼠腹水抗体效价为1︰64000。Western blotting结果显示,制备的MAb能够与C型流感病毒PB2发生特异性免疫反应;激光共聚焦试验结果表明,该MAb可准确检测C型流感病毒PB2的亚细胞定位。本研究通过huANP32A蛋白高效富集了C型流感病毒的RdRp,并以该复合物为抗原制备的PB2 MAb具有较好的特异性,为C型流感病毒聚合酶检测、结构分析及机制研究奠定了基础。

关键词： C型流感病毒 PB2 huANP32A 单克隆抗体

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非洲猪瘟病毒E184L蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

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中国动物传染病学报 2023年

作者：李雪雯李婷婷李长尧焦爽郑君荣俊翁长江长江大学生命科学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队黑龙江省兽医免疫学重点实验室

本研究旨在表达非洲猪瘟病毒（ASFV）E184L蛋白（pE184L），并制备单克隆抗体（mAb），为其功能研究提供物质基础。首先，构建出了原核表达质粒pET21a-E184L并表达重组pE184L-His蛋白，使用镍亲和层析的方法对pE184L进行纯化，用纯化后... 详细信息

本研究旨在表达非洲猪瘟病毒（ASFV）E184L蛋白（pE184L），并制备单克隆抗体（mAb），为其功能研究提供物质基础。首先，构建出了原核表达质粒pET21a-E184L并表达重组pE184L-His蛋白，使用镍亲和层析的方法对pE184L进行纯化，用纯化后的蛋白对小鼠进行免疫，随后将阳性小鼠进行迫杀并取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合，经间接ELISA方法筛选出能稳定分泌pE184L mAb的杂交瘤细胞。Western blot结果该抗体能够特异性识别过表达的外源pE184蛋白以及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞（PAMs）表达的内源pE184蛋白。IFA结果表明该株mAb能特异性标记过表达的pE184L蛋白及在ASFV感染的PAMs细胞中表达的内源pE184L蛋白。Co-IP试验结果表明该株mAb能特异性结合过表达的pE184L蛋白及在ASFV感染的PAMs细胞中表达的内源pE184L蛋白。本研究成功表达并纯化了可溶性E184L蛋白，并制备了一株pE184L mAb，该mAb与pE184L蛋白具有良好的反应性，这为ASFV pE184L的生物学功能研究奠定了基础。

关键词： ASFV E184L 原核表达单克隆抗体

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猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体的制备及其中和活性鉴定

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中国兽医学报 2023年第2期43卷 223-228页

作者：李淑红刘平黄孙慧敏仇华吉李素中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 中国农业大学动物医学院北京100193

本实验室前期制备了1株分泌针对猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞株6E10,并验证其可特异性识别CSFV E2蛋白。由于杂交瘤细胞不稳定且不易储存,本研究将6E10抗体的轻、重链可变区基因和猪源抗体的恒定区基因融合并克隆至... 详细信息

本实验室前期制备了1株分泌针对猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞株6E10,并验证其可特异性识别CSFV E2蛋白。由于杂交瘤细胞不稳定且不易储存,本研究将6E10抗体的轻、重链可变区基因和猪源抗体的恒定区基因融合并克隆至慢病毒表达载体pFUGW,分别构建了携带Strep标签的重组猪源化抗体轻、重链基因的慢病毒质粒pFU-p6E10-LC-Strep和pFU-p6E10-HC-Strep,进一步制备了慢病毒Lenti-p6E10-LC-Strep和Lenti-p6E10-HC-Strep,将二者共转导至HEK293S悬浮细胞,成功表达并纯化了重组猪源单克隆抗体6E10(p6E10)。经ELISA试验及Western blot证实,p6E10抗体能特异性识别E2蛋白。中和试验结果显示,p6E10抗体可以中和CSFV石门株。结果表明,本研究成功获得了针对CSFV E2蛋白的重组猪源化单克隆抗体p6E10,为深入研究CSFV E2蛋白的结构和功能以及开发新型诊断制剂奠定了基础。

关键词：猪瘟病毒 E2蛋白猪源化单克隆抗体悬浮培养

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2020-2021年中国部分活禽市场中classⅠ类新城疫病毒的分子特征遗传演化和耐热性分析

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中国兽医科学 2023年第4期53卷 491-498页

作者：张春玮孙军峰张智颖陈林娜刘添仪韩宗玺刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽呼吸道传染病创新团队黑龙江哈尔滨150069

对2020—2021年期间分离自10个省(自治区)活禽市场不同宿主与部分环境中的新城疫病毒(NDV)进行鉴定,获得了31株classⅠ类NDV。F基因分子特征分析显示,classⅠ类NDV F基因中起始密码子存在突变,导致产生不同长度的编码序列。氨基酸序列... 详细信息

对2020—2021年期间分离自10个省(自治区)活禽市场不同宿主与部分环境中的新城疫病毒(NDV)进行鉴定,获得了31株classⅠ类NDV。F基因分子特征分析显示,classⅠ类NDV F基因中起始密码子存在突变,导致产生不同长度的编码序列。氨基酸序列分析结果显示,大部分毒株的F蛋白具有典型的弱毒株裂解位点基序,但个别毒株的裂解位点存在特征性的突变。F蛋白中融合肽、N-连接的糖基化位点、中和表位以及七肽重复区域在这31个毒株之间高度保守,而信号肽区域中存在众多的氨基酸替换。HN蛋白中仅N-连接的糖基化位点在31个毒株之间保守,中和表位和七肽重复区域均存在氨基酸替换。此外,首次发现了HN编码区长度为1728 nt的突变毒株。遗传进化分析显示,与其他国家和地区的毒株不同,我国的classⅠ类NDV形成了独特的进化分支,即基因亚型1.1.2。耐热性测定结果显示,classⅠ类NDV分离株表现出不同程度的耐热特性。本研究结果为我国classⅠ类NDV的遗传变异和生物学特性研究奠定了基础。

关键词：新城疫病毒分子特征遗传进化热稳定性

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针对非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因的TaqMan荧光定量PCR的建立

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中国农业科学 2021年第5期54卷 1073-1080页

作者：王涛韩玉潘力王冰孙茂文王翌罗玉子仇华吉孙元中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室

【目的】建立一种以MGF360-13L基因为靶标的实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法,为非洲猪瘟(African swine fever, ASF)的诊断、MGF360-13L基因缺失毒株鉴别、病毒分离鉴定、基因功能研究提供技... 详细信息

【目的】建立一种以MGF360-13L基因为靶标的实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法,为非洲猪瘟(African swine fever, ASF)的诊断、MGF360-13L基因缺失毒株鉴别、病毒分离鉴定、基因功能研究提供技术支持。【方法】首先,以ASFV中国流行毒株(GenBank:MK333180.1)的MGF360-13L基因序列为靶标设计并筛选了1对特异性引物和探针,建立其荧光定量PCR检测方法。设计引物13L-F/13L-R,扩增MGF360-13L,并将其克隆至pOK12载体,挑取阳性克隆并测序验证,构建重组质粒标准品。将重组质粒标准品连续10倍梯度稀释,以稀释后的各梯度质粒标准品为模板,配制反应体系和设置反应条件后进行荧光定量PCR检测,建立标准曲线,并对其敏感性和重复性进行评价;其次,以连续10倍梯度稀释的重组质粒标准品为模板,利用引物13L-F/13L-R进行常规PCR检测,以比较荧光定量PCR的敏感性。最后,运用本检测方法和本研究组已建立的针对ASFV p72的荧光定量PCR检测方法同时对黑龙江某猪场发生ASF时采集的30份临床样品进行检测,以比较两种检测方法的符合率。另外,应用该方法对感染原代巨噬细胞的ASFV野毒株和MGF基因缺失毒株进行鉴别检测。【结果】利用引物13L-F/13L-R可扩增出一条800 bp左右的特异性目的条带,而阴性对照无条带,成功构建出标准品。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法在质粒标准品为1.56×10～1-1.56×10～8拷贝/μL时,呈现出良好的线性关系,线性回归方程为:y=-3.295 lg(x)+45.995,线性相关系数R2为0.997,对ASFV核酸最低检测限为15.6拷贝/μL。在特异性检验中,除ASFV核酸外,猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型等病毒核酸均未出现扩增曲线,表明该方法的特异性良好。与最低检测限为1.56×10～4拷贝/μL病毒核酸的常规PCR检测方法相比,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法高出其约3个数量级,具有较高的敏感性。在临床样品检测中,两种检测方法经过McNemar检验,P=0.5>0.05,表明两种检测方法的结果无统计学差异;经过Kappa检验,Kappa=0.867>0.75,P<0.001,提示两种检测方法符合率较好,能够有效区分ASFV野毒株和MGF360-13L基因缺失毒株。【结论】建立的TaqMan荧光定量PCR特异、敏感、重复性好,不仅丰富了ASFV现有检测靶标,也为后续MGF360-13L功能、MGF缺失毒株的鉴定及相应基因缺失疫苗株的鉴别诊断提供技术支持。

关键词：非洲猪瘟病毒 MGF360-13L 荧光定量PCR 鉴别诊断

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增强型猫ω干扰素的筛选及抗病毒活性分析

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中国预防兽医学报 2022年第2期44卷 195-201,213页

作者：李茵潘玉迪田进曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为获得增强型猫ω干扰素(FeIFN-ω),本研究通过分子对接方法预测和参考相关位点研究,设计3组定点突变引物。以pJET-FeIFN-ω为模板分别扩增FeIFN-ω基因及其3个突变基因(FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R),并连接慢病毒载... 详细信息

为获得增强型猫ω干扰素(FeIFN-ω),本研究通过分子对接方法预测和参考相关位点研究,设计3组定点突变引物。以pJET-FeIFN-ω为模板分别扩增FeIFN-ω基因及其3个突变基因(FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R),并连接慢病毒载体pLVX-IRSE,构建重组质粒pLVX-FeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、p LVX-FeIFN-ω-T188R。4个重组质粒分别与包装质粒psPAX2和膜蛋白质粒pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,48 h后收获细胞上清即为慢病毒。分别将4个慢病毒转导293悬浮细胞(293s),扩大培养后收获细胞上清,经镍离子亲和层析柱纯化蛋白,并经SDS-PAGE检测、BCA法测蛋白浓度。结果显示,rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R在293s细胞中得到高效表达,且蛋白纯化效果好;经BCA法测浓度,4种重组蛋白浓度均约为200μg/mL,即获得了重组干扰素rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R。4种重组干扰素分别经猫肾细胞(CRFK)孵育18 h后接种猫杯状病毒(FCV)或猫疱疹病毒(FHV)12 h,经相对荧光定量PCR法检测干扰素抗FCV和FHV活性;4种重组干扰素分别经CRFK细胞孵育12 h,经相对荧光定量PCR法检测干扰素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1的转录水平,结果显示:实验组与空白对照组差异极显著(P<0.01),实验组中rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R与rFeIFN-ω均差异不显著(P>0.05)或表现为活性降低,rFeIFN-ω-T188R与rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R差异均显著(P<0.05)表现为活性增强,并且r FeIFN-ω-T188R抗病毒活性及诱导ISGs的转录水平均比rFeIFN-ω高1倍左右。选择r FeIFN-ω和rFeIFN-ω-T188R分别与His纯化树脂结合,加入等量表达干扰素受体(IFNAR1/R2)的重组质粒转染293T细胞的裂解液,4℃结合过夜,经western blot鉴定干扰素与IFNAR1/R2结合亲和力分析,结果显示,rFeIFN-ω-T188R与IFNAR1的结合能力比r FeIFN-ω高1倍左右,且两者与IFNAR2的结合能力差异不显著。本研究成功筛选到增强型rFeIFN-ω-T188R,为研究高效FeIFN-ω药物奠定了基础。

关键词：猫ω干扰素真核表达生物活性

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牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白在杆状病毒中的表达及抗原性鉴定

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中国预防兽医学报 2022年第1期44卷 34-40页

作者：杨木娇林俊张娟王婉向文杰薛飞朱远茂中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了获得具有良好抗原性的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gE蛋白,本研究采用PCR方法扩增全长gE基因,并在其5’端引入蜂素信号肽(HBM)以增加表达蛋白的分泌,将其克隆至pFastBac1供体质粒中,构建重组质粒pFB-gE。将测序正确的p FB-gE转化... 详细信息

为了获得具有良好抗原性的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gE蛋白,本研究采用PCR方法扩增全长gE基因,并在其5’端引入蜂素信号肽(HBM)以增加表达蛋白的分泌,将其克隆至pFastBac1供体质粒中,构建重组质粒pFB-gE。将测序正确的p FB-gE转化至DH10Bac感受态细胞中获得重组杆粒(rBacmid-gE),经PCR鉴定后将阳性r Bacmid-gE转染Sf21细胞,获得重组杆状病毒(rBV)。对不同代次的rBV进行PCR鉴定,结果表明获得了整合gE基因的r BV,且能稳定传代。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,接种rBV的Sf21细胞与gE抗体阳性牛血清反应后出现绿色荧光,而与阴性牛血清不反应,表明g E基因在rBV中获得正确表达。大量培养rBV,收获培养上清液,对重组gE蛋白(rgE)纯化,纯化后的rgE浓度为0.78 mg/mL。对纯化后的rgE进行western blot检测,结果显示,rgE能与g E抗体阳性兔血清和羊血清反应,与IBRV-56(g E基因缺失株)免疫兔血清和健康羊血清均不反应,表明rgE具有较强的反应原性。采用rgE对4只小鼠进行两次免疫,通过间接ELISA方法检测小鼠血清抗体,结果显示,rgE可诱导小鼠产生特异性抗体,表明rgE具有良好免疫原性。本研究为IBRV gE蛋白结构和功能的研究奠定了一定基础,为gE基因缺失疫苗免疫牛与自然感染牛的鉴别诊断提供了物质基础。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gE基因糖蛋白E 重组杆状病毒表达

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伪狂犬病病毒感染小鼠的背根神经节后天然免疫相关转录组测序及分析

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中国预防兽医学报 2022年第6期44卷 591-597页

作者：王冰吴红霞李淼高莹袁梦淇仇华吉孙元中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

伪狂犬病病毒(PRV)的天然宿主是猪,但是能够感染多种哺乳动物。PRV是一种嗜神经性α疱疹病毒,小鼠感染PRV后会产生严重的神经症状和神经炎症。为了探究小鼠感染PRV后其背根神经节(DRG)的天然免疫应答情况,本研究将PRV TJ株以10^(6)pfu... 详细信息

伪狂犬病病毒(PRV)的天然宿主是猪,但是能够感染多种哺乳动物。PRV是一种嗜神经性α疱疹病毒,小鼠感染PRV后会产生严重的神经症状和神经炎症。为了探究小鼠感染PRV后其背根神经节(DRG)的天然免疫应答情况,本研究将PRV TJ株以10^(6)pfu剂量接种小鼠,在濒死期剖杀小鼠,取其DRG进行转录组测序,并使用DESeq2软件对测序结果分析,结果显示,与对照组相比,PRV感染小鼠的DRG内共有6 502条基因的转录水平发生改变,其中转录水平升高的基因有3 703条,降低的基因有2 799条(差异倍数>2,且P≤0.05)。利用clusterProfiler R软件对发生差异转录的基因进行了KEGG分析,结果显示,转录水平发生差异的基因参与细胞内20种信号通路途径,其中12条信号通路与天然免疫反应有关,提示PRV感染小鼠后会激活DRG内广泛的天然免疫反应。差异转录基因数量最多的5条天然免疫信号通路分别是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、细胞凋亡(Apoptosis)信号通路和信号转导及转录激活因子(JAK-STAT)信号通路,上述天然免疫反应通路可能在PRV诱导的神经炎症方面有重要作用。本研究随机选择了10条转录水平存在差异的基因,采用荧光定量PCR验证,结果显示其变化趋势均与转录组测序数据一致。本研究首次分析了PRV感染小鼠DRG内转录组的变化,为研究PRV感染后诱导宿主的天然免疫反应相关信号通路提供了参考,并为PRV致病机制等相关研究奠定了基础。

关键词：伪狂犬病病毒小鼠背根神经节转录组测序差异转录基因

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全局调控因子FNR对产肠毒素大肠杆菌生物学特性影响的研究

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 977-983页

作者：杨延毛曌江丰伟李干武中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究全局调控因子富马酸盐和硝酸盐减少调控蛋白(FNR)对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)生物学特性的影响,本研究通过Red同源重组方法构建了ETEC MD724-020菌株fnr基因的缺失株Δfnr及回补株Δfnr(pfnr),分别将ETEC野生株(WT)、Δfnr以及Δfnr... 详细信息

为研究全局调控因子富马酸盐和硝酸盐减少调控蛋白(FNR)对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)生物学特性的影响,本研究通过Red同源重组方法构建了ETEC MD724-020菌株fnr基因的缺失株Δfnr及回补株Δfnr(pfnr),分别将ETEC野生株(WT)、Δfnr以及Δfnr(pfnr)同时接种于TSB液体培养基培养,测定fnr基因缺失前后ETEC的生长曲线,结果显示,与野生株相比,缺失fnr基因后其生长速率无明显变化。将3株菌分别接种于TSB固体培养基,通过测定游走直径比较分析野生株、缺失株和回补株的运动性,结果显示,与野生株相比,缺失株Δfnr的运动能力显著降低(P<0.05)。采用结晶紫法检测3株菌生物被膜(BF)形成能力,结果显示,相比WT和Δfnr(pfnr)株,缺失株Δfnr BF形成能力极显著下降(P<0.001)。将3株菌分别于含10%绵羊血的TSA平板上划线培养,进行溶血性试验,结果显示,相比WT和Δfnr(pfnr)株,Δfnr株溶血圈较野生株显著缩小。将3株菌分别与猪小肠上皮细胞IPEC-J2互作2 h后,通过平板计数法分析各菌株对该细胞的黏附能力,结果显示,与野生株相比,缺失株Δfnr对IPEC-J2细胞的黏附能力显著减弱(P<0.05)。提取上述互作后未黏附细菌的RNA,通过荧光定量PCR检测fnr基因缺失后对致病性ETEC相关毒力基因转录水平的影响,结果显示,与野生株相比,Δfnr株中eaeH、eltA和hlyA基因的转录水平均极显著下降(P<0.001)。本研究首次对全局调控因子FNR影响ETEC的运动性、溶血性、BF形成能力等生物学特性进行了研究,为进一步开展ETEC致病机理的研究提供了参考依据。

关键词：产肠毒素大肠杆菌 FNR 生物学特性

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甘草酸通过HMGB1/TLR4/JNK信号通路抗猪急性腹泻综合症冠状病毒感染的研究

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中国预防兽医学报 2022年第10期44卷 1076-1083页

作者：冯书风时洪艳张记宇陈建飞张鑫张燎原冯廷帅景朝阳季朝阳石达冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

猪急性腹泻综合症冠状病毒(SADS-CoV)是一种新发现的肠道冠状病毒,引起仔猪严重的临床腹泻和肠道病理损害。为探究甘草提取物的主要成分甘草酸(GLY)抑制SADS-CoV复制的机制,本研究利用不同浓度的GLY对非洲绿猴肾细胞(Vero E6)和猪回肠... 详细信息

猪急性腹泻综合症冠状病毒(SADS-CoV)是一种新发现的肠道冠状病毒,引起仔猪严重的临床腹泻和肠道病理损害。为探究甘草提取物的主要成分甘草酸(GLY)抑制SADS-CoV复制的机制,本研究利用不同浓度的GLY对非洲绿猴肾细胞(Vero E6)和猪回肠上皮细胞(IPI-2I)预处理2 h并感染不同浓度的SADS-CoV后,分别经western blot和TCID_(50)检测,结果显示N蛋白的表达量显著减少且病毒滴度下降,表明GLY在体外能够抑制SADS-CoV的感染。利用不同浓度GLY对Vero E6和IPI-2I细胞预处理2 h后,感染灭活的SADS-CoV,western blot结果显示在GLY浓度为0.8 mmol/L时,N蛋白表达量显著减少,表明GLY能够抑制该病毒的侵入。选取0.4 mmol/L GLY处理细胞,再感染SADS-CoV后2 h、6 h、12 h收取细胞样品经western blot检测,结果显示各时间点N蛋白表达量均显著减少,表明GLY对该病毒的复制抑制效果显著。GLY是高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的竞争性抑制剂,而HMGB1的受体主要有TLR4和RAGE,因此构建了HMGB1关键性位点(C^(45)S、C^(106)S、C^(45/106)S)突变的质粒和RAGE受体的siRNA,分别转染Vero E6细胞并感染SADS-CoV,收获上清液和细胞样品,利用western blot和TCID_(50)检测。结果显示,N蛋白表达量显著减少且病毒滴度下降,表明GLY在SADS-CoV感染时通过影响HMGB1与TLR4和RAGE的结合而发挥功能。为了进一步探究GLY发挥作用的信号通路,分别将SADS-CoV感染Vero E6和IPI-2I细胞,收获细胞样品,利用western blot检测MAPK信号通路相关蛋白的变化,结果显示p-p38、p-JNK、p-ERK表达量在感染早期和晚期上调,表明SADS-CoV感染激活了MAPK通路。利用不同浓度的GLY和TLR4抑制剂TAK对Vero E6和IPI-2I细胞预处理2 h后感染SADS-CoV,收获蛋白样品,western blot结果显示p-JNK和N蛋白表达量显著减少,其他蛋白无明显变化,表明GLY和TAK调控JNK的磷酸化,而不能调控p38和ERK的磷酸化。利用HMGB1中和抗体预处理Vero E6细胞、将HMGB1的siRNA以及构建的HMGB1关键位点突变的真核表达质粒分别转染Vero E6细胞后感染SADS-CoV,收获上述细胞样品,western blot结果显示p-JNK的表达量均减少,表明HMGB1影响了JNK的磷酸化;利用不同浓度的JNK抑制剂SP600125对Vero E6和IPI-2I预处理2 h,再感染SADS-CoV,利用western blot、TCID_(50)和IFA检测,结果显示N蛋白表达量及病毒滴度均下降且病毒复制减少,表明SP600125抑制了病毒的复制。综上所述,本研究首次证实GLY主要通过HMGB1/TLR4/JNK信号通路抑制SADS-CoV的体外复制,该通路的发现为研究抗SADS-CoV的新型药物提供了数据支持。

关键词：甘草酸猪急性腹泻综合症冠状病毒感染高迁移率蛋白B1 JNK

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