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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：马健男杨涛徐青元孙恩成林燕步志高吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室

为制备针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体。本研究以原核表达的重组NS1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。以真核表达的重组NS1蛋白为检测用抗原,建立间接ELISA检测方法... 详细信息

为制备针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体。本研究以原核表达的重组NS1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。以真核表达的重组NS1蛋白为检测用抗原,建立间接ELISA检测方法筛选分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。并利用

关键词：单克隆抗体 NS1 特异性

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蓝舌病病毒16型VP2蛋白型特异性单克隆抗体的制备及特性鉴定

蓝舌病病毒16型VP2蛋白型特异性单克隆抗体的制备及特性鉴定

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第八届全国免疫学学术大会

作者：王文世孙恩成刘霓红杨涛徐青元秦永丽赵晶冯瑜菲李俊平魏鹏张翠云吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室

研究背景:蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起,由库蠓等昆虫传播的反刍动物非接触性传染病[1];主要侵害绵羊、山羊,牛为隐性感染。由于发病绵羊持续高热、消瘦、口鼻和胃粘膜出现溃疡损伤、口腔粘膜及舌头发蓝,因此命名为... 详细信息

研究背景:蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起,由库蠓等昆虫传播的反刍动物非接触性传染病[1];主要侵害绵羊、山羊,牛为隐性感染。由于发病绵羊持续高热、消瘦、口鼻和胃粘膜出现溃疡损伤、口腔粘膜及舌头发蓝,因此命名为蓝舌病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为须通报疾病,我国规定为一类动物传染病。现已确定蓝舌病有26个血清型。目的:BTV的多型性和在不同血清型之间无交互免疫性的特点,使免疫接种产生一定困难。建立相关的型特异性诊断方法 ,以便在免疫接种前确定当地流行的病毒血清型,选用相应血清型的疫苗,才能收到满意的免疫效果,这对蓝舌病的防控具有重要意义。方法:本实验利用真核表达系统表达BTV16 VP2蛋白作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,以真核表达纯化的BTV16 VP2蛋白作为包被抗原,同时利用野生型杆状病毒表达蛋白作为包被抗原对照,通过建立的间接ELISA筛选方法用于阳性杂交瘤细胞的筛选,制备针对BTV16 VP2的型特异性单克隆抗体。结果:Western Blot鉴定筛选得到4株MAbs均与真核表达的重组BTV16 VP2蛋白及天然BTV16 VP2蛋白呈阳性反应,而与野生型杆状病毒表达蛋白对照及BHK-21细胞对照呈阴性反应。IFA鉴定4株MAbs均只与BTV16呈阳性反应,而与BTV剩余23个血清型、茨城病病毒、中山病病毒、赤羽病病毒均呈阴性反应。结论:本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达的重组蛋白BTV16 VP2作为免疫原,筛选获得四株针对BTV16 VP2的MAbs,具有良好的型特异性,为BTV16型特异性检测方法建立和BTV16 VP2功能分析奠定了基础。

关键词： 16型蓝舌病病毒 VP2蛋白真核表达单克隆抗体

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蓝舌病病毒新型NS4蛋白的亚细胞定位分析及其功能预测

蓝舌病病毒新型NS4蛋白的亚细胞定位分析及其功能预测

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十一次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第二十次学术研讨会

作者：吕爽杨涛徐青元孙恩成张继凯吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室

研究目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由蓝舌病病毒BTV引起的反刍动物绵羊等的虫媒传染病。NS4是新发现的BTV的一种非结构蛋白,位于S9基因上,与VP6的ORF相重叠,实验证实其是复制非必需蛋白,具有非典型核定位信号,在干扰素应答适应性中扮演... 详细信息

研究目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由蓝舌病病毒BTV引起的反刍动物绵羊等的虫媒传染病。NS4是新发现的BTV的一种非结构蛋白,位于S9基因上,与VP6的ORF相重叠,实验证实其是复制非必需蛋白,具有非典型核定位信号,在干扰素应答适应性中扮演着重要角色[1]。但对于NS4的研究刚刚起步,信息仍然十分匮乏,本文进一步探究了NS4的亚细胞定位并预测了其功能结构,为深

关键词：亚细胞定位 NS4 核定位信号功能预测

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蓝舌病病毒群特异性单克隆抗体的制备

蓝舌病病毒群特异性单克隆抗体的制备

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：耿宏伟杨涛马健男孙恩成王凌凤魏鹏秦永丽吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室

本研究以原核表达的血清型17型蓝舌病病毒(BTV-17)的VP7蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,以BHK-21细胞繁殖的血清型12型蓝舌病病毒

关键词：单克隆抗体特异性

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H5N1亚型禽流感核蛋白T细胞表位区的研究

H5N1亚型禽流感核蛋白T细胞表位区的研究

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：王群刘光亮肖一红张维军吴东来农业部兽医公共卫生重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所哈尔滨 150001

细胞免疫反应在病毒感染的清除中起了重要的作用。针对保守表位的记忆性T细胞可以抵抗异源病毒的攻击。在本研究中,通过禽痘病毒表达系统对AIVA/Goose/Guangdon/1/96(H5N1)(GD1/96)株NP进行T细胞表位作图。将全长NP分为互相重叠的6段,... 详细信息

细胞免疫反应在病毒感染的清除中起了重要的作用。针对保守表位的记忆性T细胞可以抵抗异源病毒的攻击。在本研究中,通过禽痘病毒表达系统对AIVA/Goose/Guangdon/1/96(H5N1)(GD1/96)株NP进行T细胞表位作图。将全长NP分为互相重叠的6段,分别构建含有6个节段和全长的重组FPVs(rFPVs),使用构建的重组rFPVs体外刺激经NP重组DNA疫苗免疫的鸡脾淋巴细胞,分别通过流式细胞术、ELISA和real-time RT-PCR监测刺激后细胞增殖、ChIFN-γ表达和转录的情况,结果显示,我们所获得的五株重组毒rFPlV-NP1、rFPV-NP3、rFPV-NP4、rFPV-NP5和rFPV-NP中,rFPV-NP5能明显刺激活化后细胞的增殖及ChIFN-γ表达和转录,从而确定在AIV GD1/96NP(NP277-421)的羧基端存在至少1个T细胞表位。

关键词：禽流感病毒核蛋白细胞免疫 T细胞表位病毒感染鸡脾淋巴细胞流式细胞术

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西尼罗病毒NS1基因的原核表达与抗原性鉴定

西尼罗病毒NS1基因的原核表达与抗原性鉴定

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：马健男吴东来杨涛王群张维军徐青元田野林燕宋红梅步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨 150001

通过PCR方法扩增西尼罗病毒(WNV)NY99株NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c2X上,构建出重组表达质粒pc2X-NS1,经IPTG诱导得到可溶性的麦芽糖结合蛋白(MBP)-NS1融合蛋白(MBP-NS1),其分子质量约为90 ku,大约占可溶性菌体蛋白的50％... 详细信息

通过PCR方法扩增西尼罗病毒(WNV)NY99株NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c2X上,构建出重组表达质粒pc2X-NS1,经IPTG诱导得到可溶性的麦芽糖结合蛋白(MBP)-NS1融合蛋白(MBP-NS1),其分子质量约为90 ku,大约占可溶性菌体蛋白的50％。利用直链淀粉树脂柱对MBP-NS1纯化后的重组蛋白的纯度达到60％,Western-blot和间接ELISA检测证明纯化的MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性。

关键词：西尼罗病毒原核表达抗原性鉴定融合蛋白

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PRRSV GP5蛋白原核表达载体的构建与鉴定

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畜牧兽医科技信息 2009年第4期25卷 48-49页

作者：田野张维军田志军吴东来张守发中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001 延边大学农学院龙井133400

通过RT-PCR获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)CH-1a株GP5蛋白基因,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1,构建原核重组质粒(pGEX-GP5),转化至***21感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示重组蛋白以包涵体形式得到了表达,Westernblot与间接ELISA试验分析表明,该蛋白与PRRSV阳性血清具有良好的免疫反应性。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白免疫原性

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蓝舌病病毒重组VP7蛋白单克隆抗体制备及竞争ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2012年第5期34卷 388-392页

作者：耿宏伟秦永丽李俊平杨涛孙恩成刘霓红白安斌徐青元王凌凤赵晶覃绍敏林俊郭怡璠吴东来东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江省农业科学院黑龙江哈尔滨150086 广西兽医研究所广西南宁530001 广西大学广西南宁530004

为了建立蓝舌病(BT)的血清学诊断方法,本研究利用原核表达的蓝舌病病毒(BTV)血清型12型VP7纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备2株单克隆抗体(MAb),分别命名为BTV-2D10和BTV-4H7。IFA试验表明,2株MAb均能与BTV 24个血清型发生特异性反应,而与... 详细信息

为了建立蓝舌病(BT)的血清学诊断方法,本研究利用原核表达的蓝舌病病毒(BTV)血清型12型VP7纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备2株单克隆抗体(MAb),分别命名为BTV-2D10和BTV-4H7。IFA试验表明,2株MAb均能与BTV 24个血清型发生特异性反应,而与茨城病病毒(IBAV)、中山病病毒(CV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛呼肠孤病毒(RV)及口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应,表明2株MAb均为BTV群特异性抗体。采用重组表达的VP7蛋白作为包被抗原建立的竞争ELISA方法证明,BTV-4H7 MAb对不同血清型BTV阳性血清具有良好的阻断效果,而对AKAV、IBAV、BRV和FMDV阳性血清无阻断作用。本研究建立的竞争ELISA方法与IDEXX公司的试剂盒检测包括65份已知背景血清和322份采自广西省的山羊血清样品,检测结果符合率分别达100%和98%。该竞争ELISA方法的建立为BTV抗体的监测提供了安全、快速、准确的技术手段。

关键词：蓝舌病病毒重组VP7蛋白群特异性单克隆抗体竞争ELISA

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蓝舌病病毒核酸通用检测方法的建立

蓝舌病病毒核酸通用检测方法的建立

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2013年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会

作者：冯瑜菲徐青元杨涛孙恩成李俊平吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001 东北农业大学哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001

目的：建立具有群特异性的BTV通用核酸检测方法，为有效的防控蓝舌病奠定了基础。方法：利用DNAMAN生物学软件，比对了GenBank中26个不同血清型BTV的共104条S10基因的核酸序列，选取最保守的序列区域设计特异性引物，并利用PubMed中的BL... 详细信息

目的：建立具有群特异性的BTV通用核酸检测方法，为有效的防控蓝舌病奠定了基础。方法：利用DNAMAN生物学软件，比对了GenBank中26个不同血清型BTV的共104条S10基因的核酸序列，选取最保守的序列区域设计特异性引物，并利用PubMed中的BLAST软件将设计的引物与GenBank中病毒的核酸序列进行比对，以分析其特异性。利用设计的特异性引物对BTV1-24共24个血清型毒株的RNA用Quant One Step RT-PCR Kit进行one stepRT-PCR检测，以验证该引物的通用性。同时，以IBAV,CV和AKAV的RNA为模板，进行one step RT-PCR检测，以验证该引物的特异性。并通过已知浓度的BTV-16的RNA样品，按照确定的检测体系进行one step RT-PCR检测，以测定该方法的灵敏度。对人工感染BTV-16的46份羊的抗凝血样品用QIAampRNA Blood Mini Kit进行RNA提取，并进行one step RT-PCR检测。每组实验进行三次重复。结果:通过试验成功设计了BTV核酸特异性通用检测引物，并成功建立了BTV群特异性one step RT-PCR检测方法。该方法可有效检测出不同血清型BTV核酸，而对IBAV,CV和AKAV无交叉反应，特异性好;同时，该方法可成功检测到102 TCID50/mL的BTV核酸;该方法也可有效检测出羊的抗凝血样品中的BTV核酸。结论:通过比对104条26个不同血清型BTV S10基因的核酸序列，其同源性可高达90. 55％，并在不同血清型BTV中存在两段高度保守的核酸区域，这为设计BTV特异性通用检测引物提供了有利的基础。本实验筛选得到的一对特异性引物对BTV1-24型都发生特异性反应，具有良好的群特异性，为建立快速、敏感、特异性的BTV通用核酸诊断方法奠定了基础。

关键词：动物医学蓝舌病病毒群特异性核酸检测

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流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：霍红李业南薛遥郭立平王晓磊步志高华荣虹中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,本实验根据JEV的E基因保守序列设计一对特异性引物及探针,并以E基因重组质粒作为标准品,建立检测JEV的TqMan荧光定量PCR方法.结果显示,该方法的灵敏度可达到10个拷贝,是常规PCR灵敏度的100... 详细信息

为建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,本实验根据JEV的E基因保守序列设计一对特异性引物及探针,并以E基因重组质粒作为标准品,建立检测JEV的TqMan荧光定量PCR方法.结果显示,该方法的灵敏度可达到10个拷贝,是常规PCR灵敏度的100倍.该方法对其它相关猪病病毒的检测显示均为阴性,特异性好.重复性试验表明该方法的组间和组内的变异系数均小于2％.通过检测未免疫猪和免疫减毒活疫苗猪在感染JEV后的病毒血症及内脏病毒载量,将该方法与JEV传统病毒分离方法进行比较,结果表明该方法与乳鼠脑内接种方法灵敏度相同,比细胞分离方法灵敏度高.本研究可以作为临床检测JEV病毒及评价疫苗保护效力的检测方法.

关键词：猪乙型脑炎病毒基因检测荧光定量聚合酶链反应效果评估

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