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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十九次学术研讨会

作者：王海秀孙恩成徐青元杨涛吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001

目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起的反刍动物虫媒(如库蠓、伊蚊等)传染病.本研究旨在制备NS1蛋白的MAbs,并对其生物学特性进行鉴定,旨在为蓝舌病病毒诊断与相关基础研究奠定基础. 方法:根据Genb... 详细信息

目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起的反刍动物虫媒(如库蠓、伊蚊等)传染病.本研究旨在制备NS1蛋白的MAbs,并对其生物学特性进行鉴定,旨在为蓝舌病病毒诊断与相关基础研究奠定基础. 方法:根据Genbank中己登录的BTV12-NS1基因序列，利用Primer 5.0软件选取其ORF在5’端和3’端分别设计上下游引物后构建原核重组质粒pET BTV12-NS1和真核重组质粒pFAST BTV12-NS1，分别进行原核表达及真核表达。表达的重组蛋白经纯化鉴定后，利用原核重组BTV12-NS1蛋白免疫BALB/c小鼠，利用真核重组BTV12-NS1蛋白建立间接ELISA方法，确定检测最佳条件后筛选阳性杂交瘤细胞株并进行WB和IFA鉴定。结果:本实验共筛选出26株阳性杂交瘤细胞株，分别对其进行WB和IFA鉴定，发现26株MAbs均与Bac-to-Bac昆虫细胞表达系统表达的重组BTV12-NS1蛋白呈特异性反应，也能与接种BTV12的BHK-21细胞中表达的NS1蛋白发生特异性反应，而与接种野生杆状病毒和未接毒的BHK-21细胞不发生反应;IFA显示:3 E9,3B6,2B7,4B9四株MAbs无生物学活性，其余有22株MAbs均与感染BTV12的BHK-21细胞呈特异性免疫荧光。与感染BTV1-24的BHK-21细胞结果表明:2G5和3F6为型特异性MAbs;2E8,3C2,,3G6,3E7,4B1,4E5为群特异性MAbs;其余MAbs均有不同的反应谱系。结论:本研究所制备的抗NS1蛋白MAbs为下一步蓝舌病病毒相关研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒非结构蛋白单克隆抗体制备工艺生物学特性

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蓝舌病病毒群特异性抗原捕获ELISA方法的建立

蓝舌病病毒群特异性抗原捕获ELISA方法的建立

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十九次学术研讨会

作者：孙恩成徐青元杨涛冯瑜菲吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001

目的:蓝舌病(BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(BTV)引起的反刍动物虫媒传染病.不同流行地区易感动物的死亡率差别很大,一般可达30％,在某些地区绵羊感染后死亡率甚至高达80％.目前为止已有报道证实BT血清型已达26种之多,并且... 详细信息

目的:蓝舌病(BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(BTV)引起的反刍动物虫媒传染病.不同流行地区易感动物的死亡率差别很大,一般可达30％,在某些地区绵羊感染后死亡率甚至高达80％.目前为止已有报道证实BT血清型已达26种之多,并且每种血清型之间没有交叉保护作用,増加了BT防控的难度,因此建立切实有效的抗原检测方法对于BTV的监控闻言是至关重要的.本研究利用实验制备保存的针对于BTV VP7蛋白的单克隆抗体(MAb)建立BTV群特异性抗原捕获ELISA方法,为BTV疫苗定量以及抗原监测奠定基础. 方法:BTV灭活抗原、茨城病毒(IBAV)、赤羽病毒(AKAV)、牛轮状病毒(BRV)、口蹄疫病毒(FMDV)等由哈尔滨兽医研究所提供;采用Protein ASepharoseTM CL-4B亲和层析纯化制备的MAb 1F6与4H7腹水，利用简易过碘酸钠法进行HRP-MAb 4H7标记试验;利用矩阵法确定抗原捕获ELISA术式及反应条件。结果:建立BTV群特异性抗原捕获ELISA方法，对己知抗原BTV,IBAV,AKAV,BRV, FMDV进行检测，发现所建立的抗原捕获ELISA方法仅对BTV灭活病毒液呈阳性反应，对其它相关病毒以及BHK-21细胞裂解液呈阴性反应。敏感性检测最低检出量为400TCIDSO. 结论:本实验所建立的BTV群特异性抗原捕获ELISA方法具有较好的敏感性和特异性，可以用于BTV病原检测以及疫苗定量。

关键词：蓝舌病病毒群特异性抗原捕获方法酶联免疫吸附测定

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蓝舌病病毒15型NS3蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

蓝舌病病毒15型NS3蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十九次学术研讨会

作者：张沁孙恩成徐青元杨涛吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001

蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(BTV)引起的,以库蠓为传播媒介在反刍动物间广泛传播的虫媒性传染病.BTV病毒粒子呈二十面体对称,无囊膜,其基因组为分节段的10个片段的双股RNA,分别编码结构蛋白VP1～VP7及非结构蛋白NS1～... 详细信息

蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(BTV)引起的,以库蠓为传播媒介在反刍动物间广泛传播的虫媒性传染病.BTV病毒粒子呈二十面体对称,无囊膜,其基因组为分节段的10个片段的双股RNA,分别编码结构蛋白VP1～VP7及非结构蛋白NS1～***3蛋白由S10基因(822bp)编码,含有两个开放阅读框,分别编码229个氨基酸(aa)的NS3和216个aa的NS3a.本研究通过制备NS3的单克隆抗体(mAbs)及鉴定其抗原表位,以期为BTV的释放机制研究奠定基础.将NCBI中BTV 1~24型NS3蛋白序列进行了序列对比，结果表明1B5,2B12, 4H8所识别的抗原表位201QSYNDAVRMSFTEF216aa在BTV 1~24型NS3蛋白序列中完全保守，具有良好的BTV群特异性。

关键词：蓝舌病病毒非结构蛋白蛋白单克隆抗体抗原表位鉴定机理

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7株H3亚型禽流感病毒HA基因的遗传演化分析

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畜牧与兽医 2013年第12期45卷 6-10页

作者：黄建龙邓国华谭丹王昌建朱春霞范仲鑫何世成汪洪冰张菁邱立新鲁杏华刘道新湖南省动物疫病预防控制中心湖南长沙410007 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 湖南省动物卫生监督所湖南长沙410007

采用RT—PCR技术对近年来洞庭湖区分离的H3亚型禽流感毒株的HA基因进行扩增、克隆和测序，并对所得全序列进行同源性和遗传演化分析。结果显示：本试验分离到的7株H3亚型禽流感病毒的HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入，属于低... 详细信息

采用RT—PCR技术对近年来洞庭湖区分离的H3亚型禽流感毒株的HA基因进行扩增、克隆和测序，并对所得全序列进行同源性和遗传演化分析。结果显示：本试验分离到的7株H3亚型禽流感病毒的HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入，属于低致病性病毒；7株H3亚型毒株之间HA基因核苷酸同源性在87．6％～98．4％之间，推导氨基酸序列的同源性在93．7％～99．1％之间；从HA基因遗传演化关系来看，7株病毒毒可分为三大分支，与以往从蒙古、韩国、越南、西伯利亚及我国香港、广西、三江等地分离的H3亚型毒株关系密切，提示其HA基因来源非常复杂。

关键词： H3亚型禽流感 HA基因同源性遗传演化

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流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：赵付荣周东辉华荣虹王斌陈娜莎阿合买提·买买提步志高华南农业大学兽医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部兽医公共卫生重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒。表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白。本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒SA14-14-2株结构蛋白E蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,... 详细信息

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒。表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白。本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒SA14-14-2株结构蛋白E蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,经有限稀释法获得1株特异性针对JEVE蛋白的杂交瘤细胞,命名为5D4,经测定5D4单抗亚类属于IgG2a,轻链为κ链。经Westernblot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体可特异地与JEVE蛋白结合。结果表明,所制备的抗JEVE蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为JEV准确快速的病原诊断和JEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。

关键词：乙型脑炎病毒 E蛋白单克隆抗体

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茨城病病毒S7基因的截短表达及间接ELISA检测方法的建立

茨城病病毒S7基因的截短表达及间接ELISA检测方法的建立

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：张文龙殷喆王君伟杨涛吴东来农业部兽医公共卫生重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所东北农业大学动物医学学院

茨城病病毒(Ibaraki virus,IBAV)是呼肠孤病毒科、环状病毒属成员。其VP7蛋白保守程度高,适宜作为茨城病(Ibaraki disease,IBAD)血清学检测方法的诊断抗原。本研究克隆了VP7蛋白抗原性、亲水性较强部分的编码基因,并在原核表达系统中表... 详细信息

茨城病病毒(Ibaraki virus,IBAV)是呼肠孤病毒科、环状病毒属成员。其VP7蛋白保守程度高,适宜作为茨城病(Ibaraki disease,IBAD)血清学检测方法的诊断抗原。本研究克隆了VP7蛋白抗原性、亲水性较强部分的编码基因,并在原核表达系统中表达了可溶性截短VP7蛋白。用表达的重组蛋白初步建立了IBAD间接ELISA检测方法。

关键词：茨城病截短VP7蛋白间接ELISA

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鸡IFN-γDNA-壳聚糖纳米粒的制备及体外转染

鸡IFN-γDNA-壳聚糖纳米粒的制备及体外转染

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：殷喆张文龙刘霓红杨涛步志高王君伟吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室东北农业大学动物医学学院

构建了携带鸡干扰素（IFN- ）重组真核表达质粒pCAGGS-ChIFN-,制备成承载pCAGGS-ChIFN-的壳聚糖纳米粒子。透射电镜观察制备的纳米粒子呈不规则球形,光子相关色谱（PCS）仪测定显示纳米粒子的平均粒径为172.6±5.1nm;Zeta电位为20.8... 详细信息

构建了携带鸡干扰素（IFN- ）重组真核表达质粒pCAGGS-ChIFN-,制备成承载pCAGGS-ChIFN-的壳聚糖纳米粒子。透射电镜观察制备的纳米粒子呈不规则球形,光子相关色谱（PCS）仪测定显示纳米粒子的平均粒径为172.6±5.1nm;Zeta电位为20.8±2.9mV;载基因纳米粒子的重组质粒DNA包埋效率和载药量分别为91.21±2.54%和31.93±0.16%。载基因壳聚糖纳米粒子可以有效地保护重组质粒DNA,防止核酸酶对其的降解作用,并能良好的从纳米粒子中释放重组质粒DNA。CEF细胞体外转染实验表明:包裹后的纳米粒子对细胞基本无毒性,使携带的外源基因能在CEF细胞中正确表达,其转染效率约为阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine2000 Reagent的1/6。

关键词：壳聚糖纳米颗粒鸡γ-干扰素基因体外转染

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蓝舌病病毒8型VP2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

蓝舌病病毒8型VP2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

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2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会

作者：秦永丽孙恩成耿宏伟徐青元杨涛赵晶王文世魏鹏冯瑜菲李俊平李文京吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室中国动物疫病预防控制中心

蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的,主要由库蠓传播的反刍动物烈性非接触性传染病。BT血清型众多,目前已发现24个血清型,最近又相继分离到BTV25和26型。BTV基因组由10个线性双链... 详细信息

蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的,主要由库蠓传播的反刍动物烈性非接触性传染病。BT血清型众多,目前已发现24个血清型,最近又相继分离到BTV25和26型。BTV基因组由10个线性双链RNA片段组成,共编码11种蛋白,七种结构蛋白(VP1-VP7)和四种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4)。其

关键词：抗原表位 VP2 单克隆抗体制备

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蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

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2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会

作者：王文世孙恩成刘霓红杨涛徐青元秦永丽赵晶冯瑜菲魏鹏张翠云李文京吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室中国动物疫病预防控制中心

研究目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起,由库蠓等昆虫传播的反刍动物非接触性传染病;主要侵害绵羊、山羊,牛为隐性感染。由于发病绵羊持续高热、消瘦、口鼻和胃粘膜出现溃疡损伤、口腔粘膜及舌头发蓝... 详细信息

研究目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起,由库蠓等昆虫传播的反刍动物非接触性传染病;主要侵害绵羊、山羊,牛为隐性感染。由于发病绵羊持续高热、消瘦、口鼻和胃粘膜出现溃疡损伤、口腔粘膜及舌头发蓝,因此命名为蓝舌病。蓝舌病VP7蛋白位于病毒颗粒内衣壳的最外侧,约占病毒成分的36%,是主要的血清群特异性抗原,因此获得针对VP7蛋白的单克隆抗体,就为蓝舌病免疫学检测方法的建立奠定了基础。

关键词：单克隆抗体 BTV 群特异性抗原 VP7 生物学特性杂交瘤细胞株特异性反应

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蓝舌病病毒8型VP2蛋白的真核表达与抗原性检测

蓝舌病病毒8型VP2蛋白的真核表达与抗原性检测

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2013年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会

作者：席娜王文世冯瑜菲李俊平吴东来孙恩成孙亮魏天杨涛徐青元刘二战孙晶魏鹏中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

目的:利用真核表达系统对BTV8型VP2蛋白进行表达并对其抗原性进行检测。方法:从BTV8感染的BHK-21细胞提取病毒RNA,依据Genback中已登录的BTV8的L2基因序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增BTV8 VP2全长基因,将VP2基因和pFastBacHTA供体... 详细信息

目的:利用真核表达系统对BTV8型VP2蛋白进行表达并对其抗原性进行检测。方法:从BTV8感染的BHK-21细胞提取病毒RNA,依据Genback中已登录的BTV8的L2基因序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增BTV8 VP2全长基因,将VP2基因和pFastBacHTA供体质粒分别经BamHI和HindⅢ酶切后连接转化将其克隆到pFast-BacHTA供体质粒中构建重组pFast-VP2质粒,双酶切和测序鉴定后将pFast-VP2转化DH10Bac感受态细胞制备提取重组杆粒BAC-VP2,经PCR鉴定后在脂质体Cellfectin Reagent作用下将重组杆粒BAC-VP2转染Sf21细胞,转染后的Sf21细胞经蛋白质印迹检测VP2蛋白及其生物活性。结果:经双酶切以及测序鉴定成功构建了真核表达载体pFast-VP2,利用杆状病毒表达系统成功表达出BTV8重组蛋白VP2.通过包涵体纯化方法对其进行了纯化,Western blot结果显示该蛋白可以与抗BTV8绵羊阳性血清产生反应,显示出良好的抗原性。结论:昆虫杆状病毒表达载体具有高效性和灵活性,能高效地表达大片段基因也能同时表达多个基因,而且表达的重组蛋白经糖基化、磷酸化、二硫键的形成等翻译加工后在结构和功能上更接近天然蛋白,使得重组蛋白具有较好的生物活性。本研究构建的BTV8 VP2蛋白的真核表达载体,为后期建立稳定表达VP2蛋白的细胞模型和VP2蛋白功能研究奠定了基础。

关键词：动物医学蓝舌病病毒重组蛋白真核表达抗原性检测

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