检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2016年第2期47卷 315-324页

作者：王晓红宋林林李亮亮袁传奇姜博周恩民穆杨西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 农业部兽用药物与兽医生物技术陕西省科学观测实验站杨凌712100

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白GP5的第二胞外区在病毒复制中的作用及机制,利用PiggyBac Transposon System Vectors构建了表达删除84—119氨基酸残基的截短型GP5的重组质粒(pPBGP5Δ84-119),转染Marc-145细胞通过嘌... 详细信息

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白GP5的第二胞外区在病毒复制中的作用及机制,利用PiggyBac Transposon System Vectors构建了表达删除84—119氨基酸残基的截短型GP5的重组质粒(pPBGP5Δ84-119),转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆,筛选稳定表达GP5Δ84-119的Marc-145细胞系,并利用cck-8试剂盒检测细胞的增殖情况;用PRRSV SD16株感染筛选的细胞,通过病毒基因拷贝数和病毒滴度检测GP5Δ84-119表达对PRRSV复制影响;通过Real-time PCR和ELISA检测病毒感染前后细胞IFN-α、IFN-β、IFN-γ的表达情况。经RT-PCR、Western blot和IFA检测,GP5Δ84-119在Marc-145细胞中获得稳定表达,将此细胞命名为Marc-145-GP5Δ84-119;细胞增殖曲线显示GP5Δ84-119的表达不影响细胞的增殖;对病毒基因拷贝数和病毒滴度检测发现GP5Δ84-119的表达可以抑制PRRSV的复制,这种抑制作用可能是通过上调IFN特别是IFN-β的表达而实现的。研究表明GP5第二胞外区在PRRSV复制中发挥重要作用。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5^Δ84-119 稳定表达复制干扰素

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在肝脏肿大和产蛋率下降综合征病鸡中检出禽戊型肝炎病毒核酸

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中国兽医杂志 2016年第11期52卷 35-37页

作者：刘宝元孙亚妮陈宜阳赵钦周恩民西北农林科技大学动物医学院农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站陕西杨凌712100

为弄清辽宁某蛋鸡场鸡只产蛋量突然下降,死亡率上升及部分剖检鸡只肝脏肿大出血的原因,对采集的发病鸡肝脏组织进行病理学观察,同时对肠道内容物进行禽戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）核酸片段的RT-PCR检测。肝脏的组织病理学观... 详细信息

为弄清辽宁某蛋鸡场鸡只产蛋量突然下降,死亡率上升及部分剖检鸡只肝脏肿大出血的原因,对采集的发病鸡肝脏组织进行病理学观察,同时对肠道内容物进行禽戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）核酸片段的RT-PCR检测。肝脏的组织病理学观察发现,肝细胞坏死和汇管区周围淋巴细胞浸润;RT-PCR从肠道内容物中成功扩增到禽HEV ORF2基因的部分片段;基因序列同源性分析结果表明,其与国内禽HEV参考株的序列同源性为97.5%～99.6%,而与其他国家的HEV序列同源性为77.9%～97.6%;进化树分析表明,该序列（命名为China 15-LN）与国内其他地区及欧洲的部分分离株在同一进化分支上,同属禽HEV基因3型。

关键词：禽戊型肝炎病毒分离鉴定序列分析

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小RNA重组表达质粒转入猪体内环境释放安全性研究概况

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动物医学进展 2015年第12期36卷 161-164页

作者：寇建平孙亚妮赵钦周恩民农业部优质农产品开发服务中心北京100020 西北农林科技大学动物医学院农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站陕西杨凌712100

人工小RNA(MicroRNA,miRNA)是根据内源miRNA的生成途径人工合成的miRNA,可以模拟内源miRNA的作用方式与靶mRNA碱基互配指导靶mRNA的降解或抑制其翻译,从而对基因表达进行转录后负调控。将人工miRNA转入动物体内调控目的基因表达,已在转... 详细信息

人工小RNA(MicroRNA,miRNA)是根据内源miRNA的生成途径人工合成的miRNA,可以模拟内源miRNA的作用方式与靶mRNA碱基互配指导靶mRNA的降解或抑制其翻译,从而对基因表达进行转录后负调控。将人工miRNA转入动物体内调控目的基因表达,已在转基因动物抗病育种方面得到广泛的研究,与此同时其环境释放导致的生物安全性问题也成为国际关注的重要问题。论文综述了以RNA干扰为基础的转人工miRNA抗猪蓝耳病猪在动物逃逸、环境释放以及与转入基因与宿主基因整合等方面对环境生物安全的影响,以期为猪蓝耳病NMHCⅡ-A转基因猪的进一步研究提供生物安全保障。

关键词：重组表达质粒基因水平转移基因组整合人工miRNA

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禽HEV衣壳蛋白N端二倍体形成关键氨基酸区域的鉴定

禽HEV衣壳蛋白N端二倍体形成关键氨基酸区域的鉴定

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中国畜牧兽医学会2016年学术年会、中国畜牧兽医学会禽病学分会第十八次学术研讨会

作者：陈宜阳周恩民赵钦孙亚妮李慧霞西北农林科技大学动物医学院农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染引起蛋鸡和肉种鸡的产蛋率下降和死淘率升高,严重影响我国养禽业的健康发展。高效体外培养体系的缺乏严重阻碍了禽HEV复制和病毒组装的研究。前期通过体外表达HEV衣壳蛋白发现,天然病毒颗粒... 详细信息

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染引起蛋鸡和肉种鸡的产蛋率下降和死淘率升高,严重影响我国养禽业的健康发展。高效体外培养体系的缺乏严重阻碍了禽HEV复制和病毒组装的研究。前期通过体外表达HEV衣壳蛋白发现,天然病毒颗粒衣壳的组装通过单倍体形成二倍体,再形成多倍体,进而组装形成病毒颗粒表面。并且发现,衣壳蛋白的C端区域参与形成病毒颗粒表面的凸起,其中aa557-562区域为其关键区域。而N端区域主要参与形成颗粒的骨架,但是关于N端参与组装颗粒骨架的关键氨基酸区域却未见相关报道。本研究通过原核表达禽HEV衣壳蛋白N端区域的不同截短和突变蛋白,初步探索其N端区域形成二倍体的关键氨基酸区域,为研究禽HEV衣壳组装的机制奠定基础。利用生物信息学软件,分析禽HEV衣壳蛋白N端区域的亲疏水性和二级结构,将其N端aa23-358区域分成5段,分别为F (aa23-358)、A (aa23-183)、B (aa62-221)、C (aa109-287)、D (aa158-358)。

关键词： HEV 壳蛋白关键氨基酸二倍体

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GP5△84-119稳定表达对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

GP5△84-119稳定表达对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王晓红宋林林李亮亮袁传奇姜博周恩民穆杨西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西省科学观测实验站

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,俗称蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的接触性传染病,以妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍和各年龄阶段猪的呼吸道症状、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等为主要特征。由于PRRSV的嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用（ADE）和持续性感染等特征,目前对该病的致病机制和免疫机理都不完全清楚,对PRRS也无确实有效的防制措施。ORF5编码的GP5是一种糖基化囊膜蛋白,是PRRSV最主要的结构蛋白,在病毒的组装、入侵和诱导机体产生免疫应答方面发挥着重要作用。GP5分子质量约25ku,具有高度变异性,美洲型毒株和欧洲型毒株的GP5分别由200和201个氨基酸残基组成。成熟的GP5由氨基端信号肽（1-31aa）、胞外区、三次跨膜的疏水区和位于胞质中的亲水性羧基端组成。三次跨膜的疏水区在病毒囊膜上形成两个胞外区,美洲型毒株位于第一胞外区的氨基端的44和51位（在LV是46和53位）的糖基化位点在不同毒株间高度保守。在LV毒株,46位天冬酰胺（Asn）的糖基化对病毒的组装和感染性是绝对必须的,但Asn 53的糖基化似乎并不重要。有关第二胞外区与病毒复制的关系,目前还未见相关报道。本研究利用PiggyBac Transposon System Vectors构建了表达删除84-119氨基酸残基的截短型GP5的重组质粒(pPB-GP5),转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆,获得了稳定表达GP5的Marc-145细胞系。经RT-PCR、Western blot和激光共聚焦显微镜分析,GP5在Marc-145细胞中获得稳定表达,并将此细胞命名为Marc-145-GP5;利用cck-8试剂盒对该细胞的增殖测定证实,Gp5的表达不影响细胞的增殖。用PRRSV SD16株感染Marc-145-GP5细胞,通过病毒基因拷贝数和病毒滴度检测发现,GP5表达可以抑制PRRSV复制;进一步采用Real-time PCR和ELISA检测病毒感染前后细胞IFN-α、β、γ的表达情况,发现GP5表达通过上调IFN特别是IFN-β的表达抑制病毒复制。表明GP5第二胞外区对PRRSV的复制可以发挥调控作用。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5△84-119 稳定表达复制干扰素

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禽戊型肝炎病毒类病毒样颗粒的表达及鉴定

禽戊型肝炎病毒类病毒样颗粒的表达及鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王鑫杰赵钦孙亚妮刘宝元陈宜阳党露李慧霞周恩民西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站

2001年禽戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）被首次从患有肝炎脾大综合症的病鸡中分离获得,其主要导致鸡大肝大脾病或肝炎脾大综合征,引起鸡死淘率升高和产蛋量下降。禽HEV感染给养禽业造成严重经济损失,而且可能具有公共卫生学意... 详细信息

2001年禽戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）被首次从患有肝炎脾大综合症的病鸡中分离获得,其主要导致鸡大肝大脾病或肝炎脾大综合征,引起鸡死淘率升高和产蛋量下降。禽HEV感染给养禽业造成严重经济损失,而且可能具有公共卫生学意义。禽HEV不稳定易降解,很难从载毒样品中分离得到,而且迄今为止也仍没有高效的体外细胞培养体系,这在一定程度上阻碍了对其抗原性、致病性及传染性等相关研究。禽HEV与人、猪HEV在抗原性和遗传性上具有一定的相关性并且禽HEV的ORF2蛋白与人和猪HEV的同源性为50%左右,据此我们假设:禽HEV的衣壳蛋白可能会像人、猪HEV的类似,通过杆状病毒表达系统表达可以自我组装成VLPs,并且VLPs能够模拟天然禽HEV颗粒的表面空间结构及病毒抗原性和对宿主细胞的吸附性等生物学活性。此外,我们前期利用生物信息学软件对国内外已在真核和原核表达系统成功获得病毒样颗粒的人源HEV毒株的氨基酸区段比对分析,发现禽HEV（CaHEV毒株）ORF2蛋白与其相对应的氨基酸区域分别为（56-554aa）和（313-549aa）,同时利用三维结构预测数据库构建两段区段三维结构模型,验证其很有可能组装形成VLPs。对于真核表达系统:我们利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（Invitrogen）构建获得包含上述潜在区段重组杆状病毒N55C52（56-554aa）,分别以10 MOI接毒量感染昆虫细胞系sf9和Tn5,通过SDS-PAGE和Westem blot方法鉴定细胞培养上清中存在55kDa、53k)a和371kDa的单体蛋白。CsCl密度梯度离心在1.286g/cm左右存在白色条带,在Western blot检测中该条带复合物能与禽HEV单克隆抗体1B5特异性反应,说明该多聚体包含N55C52区段。而针对原核表达系统:我们利用大肠杆菌表达系统无融合标签表达p237蛋白（313-549aa）,获得34kDa左右包涵体蛋白,将该包涵体蛋白透析复性液体进行液相色谱鉴定,在分离峰中存在大于400kDa多聚体峰带,Western blot鉴定该多聚体能与禽HEV单抗1B5特异性反应,推测p237蛋白可自我组成病毒样颗粒。本课题的研究为下一步利用纳米粒度仪及透射电镜观察鉴定上述两种复合物是否为禽HEV-VLPs,进而利用病毒颗粒研究禽HEV抗原性及免疫学生物学特性提供了材料支撑。

关键词：禽戊型肝炎病毒复合物 HEV 病毒样颗粒多聚体

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血红素加氧酶-1代谢产物CO抑制PRRSV复制的研究

血红素加氧酶-1代谢产物CO抑制PRRSV复制的研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：张昂克蒲锋星李娜刘红亮肖书奇周恩民西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的,对全球养猪业造成重大经济损失的猪重要传染病。我们前期研究表明,诱导和过表达血红素加氧酶1（HO-1）均能够显著抑制PRRSV在PAM及Marc145细胞中的复制,但其抑制P... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的,对全球养猪业造成重大经济损失的猪重要传染病。我们前期研究表明,诱导和过表达血红素加氧酶1（HO-1）均能够显著抑制PRRSV在PAM及Marc145细胞中的复制,但其抑制PRRSV复制的机制尚不清楚。HO-1由HMOX-1基因编码,能催化血红素降解为胆绿素（BV）,Fe及一氧化碳（CO）,它们在机体中发挥重要的抗氧化、抗凋亡及抗细胞增殖作用。那么作为HO-1代谢产物之一的CO在PRRSV感染易感细胞的过程中发挥怎样的作用?有研究表明,一氧化碳释放分子-3（CORM-3）作为一种外源性的CO供体,具有抗菌活性并且能提高小鼠在病毒血症中的存活率。另有报道,CORM有显著的抗菌活性。尽管上述研究表明CO在哺乳动物的机体中具有重要的生理及生物学功能,作为HO-1的代谢产物之一,其在PRRSV感染宿主细胞中的功能并不清楚。本课题组前期的研究表明,诱导或过表达HO-1能抑制PRRS病毒的复制,而HO-1上调表达能够促进其代谢产物之一CO的产生。那么,HO-1抑制PRRSV复制的功能是否通过CO来实现?CO在PRRSV感染过程究竟发挥什么功能?本研究在前期研究基础上利用外源性CO供体CORM-2探讨了CO对PRRSV感染易感细胞系Marc145细胞的影响。PRRSV感染细胞后,加入浓度梯度的CORM-2,48hpi收集细胞及培养上清,以检测PRRSV感染量的变化。qPCR及Western blot检测结果表明,CORM-2呈浓度梯度依赖性降低了PRRS病毒N基因的RNA及蛋白的表达水平。IFA检测结果表明,CORM-2呈现浓度梯度性抑制了PRRSV对Marc145细胞的感染。进一步测定了上清中子代病毒的滴度,结果表明,CORM-2显著抑制了细胞培养上清中子代病毒滴度。最后,利用CO特异性抑制剂-血红蛋白（Hb）与CORM-2共孵育,收集细胞样品检测PRRSV感染量的变化。qPCR及Western bolt检测结果表明,Hb部分逆转了CORM-2对PRRSV感染Marc145细胞的抑制作用。从而表明,CO能特异性的介导抗PRRSV感染Marc145细胞的作用。该研究证明了HO-1的下游代谢产物之一CO在介导HO-1的抗病毒感染过程中发挥了重要的作用,这对阐明HO-1体外抑制PRRS病毒复制的分子机制具有重要意义,也为PRRSV感染的防控提供了新的思路。

关键词： PRRSV 浓度梯度代谢产物加氧酶

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基于BAC系统的表达红色荧光蛋白的HP-PRRSV感染性克隆的构建

基于BAC系统的表达红色荧光蛋白的HP-PRRSV感染性克隆的构建

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：黄柏成孔宁李琼毅张昂克王承宝周恩民西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站

外源基因在重组病毒中的表达常表现出不稳定性,因此,一个可稳定表达外源荧光蛋白标签的高致病性PRRSV感染性克隆对于研究病毒生物学特性而言将是一个有效工具。在不同的病毒拯救系统中,细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes... 详细信息

外源基因在重组病毒中的表达常表现出不稳定性,因此,一个可稳定表达外源荧光蛋白标签的高致病性PRRSV感染性克隆对于研究病毒生物学特性而言将是一个有效工具。在不同的病毒拯救系统中,细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes,BAC)系统较其他拯救系统具有大片段可容性和复制的高保真性,且易于操作。为构建可稳定表达外源荧光蛋白标签的高致病性PRRSV感染性克隆,红色荧光蛋白(DsRed)插入至PRRSV基因组N基因和3'UTR之间,作为独立转录单元由PRRSV转录调控序列TRS2来启动转录,重组病毒在Marc-145细胞上得到拯救。在Marc-145细胞上的研究表明,拯救的病毒(rSD16/TRS2/DsRed)与亲本毒株(SD16)在生长动力学曲线和病毒滴度等生物学特性上较为一致,且红色荧光蛋白的表达在至少10代内保持着高效率的荧光密度和荧光强度,流式细胞术检测结果表明随着病毒培养时间的延长,荧光阳性细胞比率也随之增加。这一重组红色荧光高致病性PRRSV可作为研究病毒机理和生物学特征的有力工具,同时也可为其他外源标签的表达提供一个骨架式载体系统。

关键词：高致病性PRRSV DsRed 细菌人工染色体转录调控序列

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血红素加氧酶-1抑制牛病毒性腹泻病毒在靶细胞中的复制

血红素加氧酶-1抑制牛病毒性腹泻病毒在靶细胞中的复制

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：蒲锋星张冲张昂克李娜闫云欢周恩民肖书奇西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站

牛病毒性腹泻病(BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的牛的一种接触性传染病。本病主要感染牛,亦可引起猪、山羊、绵羊、白尾鹿、骆驼等动物发病,给全球养殖业,尤其是养牛业造成了巨大经济损失。尽管近年来国内外学者对该病做了大量研... 详细信息

牛病毒性腹泻病(BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的牛的一种接触性传染病。本病主要感染牛,亦可引起猪、山羊、绵羊、白尾鹿、骆驼等动物发病,给全球养殖业,尤其是养牛业造成了巨大经济损失。尽管近年来国内外学者对该病做了大量研究,但对该病的致病机制仍不十分清楚。在病毒与宿主细胞的相互作用过程中,病毒的复制依赖于宿主细胞内某些基因转录及表达水平的调节。血红素加氧酶-1(1eme oxygenase-1,HO-1),是血红素代谢过程中的限速酶,研究发现,HO-1在病原感染过程中发挥着重要的调控作用,对于不同的病原感染,其发挥的作用也不尽相同,如HO-1上调表达可促进疟原虫的感染,但却抑制HIV、HCV、HBV、Ebola和PRRRSV的感染。然而,HO-1在BVDV感染过程中的作用完全未知。本论文研究了BVDV感染对宿主细胞HO-1的影响,并明确了HO-1对BVDV感染的调控作用。首先通过荧光定量PCR和Westemblot检测发现,BVDV感染显著下调了MDBK细胞中HO-1的表达水平。然后用HO-1的激动剂钴原卟啉(CoPP)处理MDBK细胞,结果发现,无论是在BVDV感染前还是感染后,用CoPP处理靶细胞均能显着抑制BVDV复制。为了证明HO-1特异性的发挥抗BVDV感染作用,进一步应用腺病毒介导的HO-1过表达和siRNA介导的HO-1敲低表达,结果表明,腺病毒介导HO-1过表达显著抑制了BVDV对MDBK细胞的感染;而HO-1特异性siRNA敲低正常MDBK细胞中的HO-1表达,则显著促进了BVDV的感染。最后,用HO-1特异性siRNA预处理靶细胞然后再用CoPP诱导HO-1表达,则部分逆转了CoPP诱导的HO-1对BVDV感染的抑制作用。该研究证明了BVDV能够下调靶细胞中的HO-1表达,而上调HO-1表达则能显着抑制BVDV在宿主细胞中的复制。上述研究表明HO-1是一种抗病毒因子,诱导HO-1表达有望成为一种抑制BVDV感染的有效防控途径。

关键词：靶细胞宿主细胞特异性牛病毒性腹泻病毒加氧酶

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猫杯状病毒纳米PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2021年第6期51卷 684-688页

作者：赛力克·巴合达吾列提刘存刘砚涵梁瑞英秦彤梁琳崔尚金中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 山东省动物疫病预防与控制中心山东济南250010 新疆阿勒泰地区动物疾病控制与诊断中心新疆阿勒泰836500 农业部兽用药物与兽医生物技术北京科学观测实验站北京100193

为了提高猫杯状病毒(FCV)的检测效率,参考FCV全基因组序列的保守区域,利用生物学软件Primer Premier 5.0设计1对FCV特异性引物,并建立了FCV纳米PCR检测方法。结果显示,该方法特异性良好,与其他常见的猫病毒性病原均无交叉反应;该方法敏... 详细信息

为了提高猫杯状病毒(FCV)的检测效率,参考FCV全基因组序列的保守区域,利用生物学软件Primer Premier 5.0设计1对FCV特异性引物,并建立了FCV纳米PCR检测方法。结果显示,该方法特异性良好,与其他常见的猫病毒性病原均无交叉反应;该方法敏感性良好,最低检测量为5.4×10^(-3) pg/μL的标准品,是普通PCR的10倍。重复性试验结果显示,3批次重复试验结果保持一致,重复性良好。综上所述,建立的FCV纳米PCR方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可作为FCV感染的实验室诊断的技术方法。

关键词：猫杯状病毒呼吸道传染病纳米PCR

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