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黑龙江畜牧兽医 2019年第20期 87-89,177页

作者：陆静杜哲轩李泽浩王文龙内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室

为了探索建立一种有效、简便、快速、清晰、对比性强、识别度高的旋毛虫幼虫囊包标本制作方法,试验采用45%醋酸卡红原液稀释100倍染色、硼砂卡红染色、4%孔雀绿染色、苏木素染色、不染色共5种方法对肌旋毛虫进行染色对比。结果表明:45%... 详细信息

为了探索建立一种有效、简便、快速、清晰、对比性强、识别度高的旋毛虫幼虫囊包标本制作方法,试验采用45%醋酸卡红原液稀释100倍染色、硼砂卡红染色、4%孔雀绿染色、苏木素染色、不染色共5种方法对肌旋毛虫进行染色对比。结果表明:45%醋酸卡红原液稀释100倍染色法渗透作用快,染色后的虫体囊包轮廓明显,囊内幼虫结构清晰,但标本整体染色不均匀。硼砂卡红染色后标本染色较浅,染色后的虫体囊包轮廓明显,但囊内幼虫立体感差且难以观察。4%孔雀绿染色后囊内幼虫结构清晰,囊包轮廓明显,标本透明度高,便于观察。苏木素染色后标本整体颜色较深,囊内幼虫易于观察,囊包轮廓明显。说明肌旋毛虫染色标本的制作使用4%孔雀绿染色法和苏木素染色法较好,首先推荐使用4%孔雀绿染色法,其次推荐使用苏木素染色法。

关键词：肌旋毛虫染色标本孔雀绿卡红苏木素

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绵羊子宫内膜上皮细胞的培养鉴定及enJSRV囊膜蛋白及其受体Hyal2的瞬时表达

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中国兽医科学 2015年第11期45卷 1189-1195页

作者：张宇飞石晶刘淑英内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为了分离培养绵羊子宫内膜上皮细胞并瞬时表达内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)囊膜蛋白及其受体(Hyal2),采用酶消化法分离培养绵羊子宫内膜上皮细胞,差速消化法纯化细胞。应用角蛋白抗体对细胞进行免疫细胞化学鉴定。扩增enJSRVenv基因及... 详细信息

为了分离培养绵羊子宫内膜上皮细胞并瞬时表达内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)囊膜蛋白及其受体(Hyal2),采用酶消化法分离培养绵羊子宫内膜上皮细胞,差速消化法纯化细胞。应用角蛋白抗体对细胞进行免疫细胞化学鉴定。扩增enJSRVenv基因及其受体Hyal2基因,并构建真核表达质粒,同时在Hela细胞中瞬时表达。结果显示,细胞在相差显微镜下呈明显的上皮样细胞形态,同时细胞角蛋白染色阳性细胞占90%以上。成功构建了真核表达质粒pcDNA4-enJSRVenv及pcDNA4-Hyal2。Western-blot结果显示,真核表达质粒在HeLa细胞中被成功表达。本研究建立了一套高效、简便的子宫内膜上皮细胞培养方法,同时为进一步探究enJSRV囊膜蛋白的结构和功能奠定了试验基础。

关键词：内源性绵羊肺腺瘤病毒内源性反转录病毒囊膜蛋白子宫内膜上皮细胞细胞培养

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金黄色葡萄球菌CP8-ClfA-FnBPB偶联物的制备及其免疫学特性

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中国兽医学报 2013年第7期33卷 1011-1015,1031页

作者：王姝懿郝永清刘秀丽杨岚内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

以己二酰肼为间桥,碳二亚胺为偶联剂,将纯化的血清8型荚膜多糖和纯化的ClfA-FnBPB融合蛋白偶联制备偶联物,并在偶联的过程中确定其最佳质量比和偶联比。用制备的偶联物免疫小鼠,同时用间接ELISA法检测抗体水平,并对三免后2周的小鼠进行... 详细信息

以己二酰肼为间桥,碳二亚胺为偶联剂,将纯化的血清8型荚膜多糖和纯化的ClfA-FnBPB融合蛋白偶联制备偶联物,并在偶联的过程中确定其最佳质量比和偶联比。用制备的偶联物免疫小鼠,同时用间接ELISA法检测抗体水平,并对三免后2周的小鼠进行攻毒保护试验。结果显示,用化学方法制备的多糖-蛋白偶联物在其质量比为1∶2时可成功偶联,计算得到偶联比为1∶1.89。采用间接ELISA法检测抗体水平,二免后7d,偶联物免疫组可产生抗体,且抗体效价最高可达1∶6 400。阴性对照组和单独多糖组均没有抗体产生,而单独融合蛋白组在二免后产生了抗体反应,但抗体效价较低,最高时仅为1∶100。对小鼠进行攻毒保护的结果表明,偶联物组的攻毒保护率最高,可达80%,而阴性对照组、单独多糖组以及单独融合蛋白组的保护率分别为20%、30%和60%。

关键词：荚膜多糖黏附素蛋白偶联物免疫原性

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奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌诱导小鼠乳腺组织中TβRⅠ、FGFR2和PDGFRβ的表达

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中国预防兽医学报 2018年第8期40卷 720-725页

作者：毕艳楠王凤龙丁玉林缪增强陈梦娟王金玲内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为探究TβRⅠ、FGFR2和PDGFRβ对小鼠乳腺组织纤维化的作用,本研究采用奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌(***)感染小鼠乳腺后,分别于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d采集小鼠乳腺组织,应用免疫组化染色检测TβRⅠ、FGFR2和PDGFRβ在小鼠... 详细信息

为探究TβRⅠ、FGFR2和PDGFRβ对小鼠乳腺组织纤维化的作用,本研究采用奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌(***)感染小鼠乳腺后,分别于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d采集小鼠乳腺组织,应用免疫组化染色检测TβRⅠ、FGFR2和PDGFRβ在小鼠乳腺组织细胞中的表达与分布,应用荧光定量PCR和western blot方法检测小鼠乳腺组织中TβRⅠ、FGFR2和PDGFRβm RNA转录水平和这些蛋白的相对表达水平。结果显示,小鼠感染***前期(1 d^5 d) TβRⅠ、FGFR2和PDGFRβ主要在其炎性细胞和乳腺上皮细胞中表达,TβRⅠ、FGFR2和PDGFRβm RNA转录水平和蛋白表达极显著高于对照组(p<0.001),感染***后期(7 d^21 d),细胞外基质较多,TβRⅠ、FGFR2和PDGFRβ在小鼠乳腺成纤维细胞和乳腺上皮细胞中均有表达,TβRⅠ、FGFR2和PDGFRβ的表达极显著高于对照组(p<0.001)。研究表明,***感染小鼠后,能够促进乳腺组织中TβRⅠ、FGFR2和PDGFRβ的表达,从而促进小鼠乳腺纤维化。本研究为深入探究生长因子受体在乳腺纤维化的分子作用机制奠定了基础。

关键词：金黄色葡萄球菌小鼠 TβRⅠ FGFR2 PDGFRβ

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金黄色葡萄球菌诱导小鼠乳腺纤维化模型TGF-β1的表达

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中国预防兽医学报 2018年第3期40卷 237-242页

作者：毕艳楠王凤龙丁玉林王金玲赵弥张芮今缪增强内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为探究金黄色葡萄球菌(***)引起乳腺纤维化的致病分子机制,本研究以不同剂量(10~4 cfu/m L、10~6cfu/m L、10~8cfu/m L、10^(10)cfu/m L)的***感染哺乳期BALB/c小鼠乳腺组织,观察小鼠临床症状和病理组织学变化,筛选建立小鼠乳腺纤维化... 详细信息

为探究金黄色葡萄球菌(***)引起乳腺纤维化的致病分子机制,本研究以不同剂量(10~4 cfu/m L、10~6cfu/m L、10~8cfu/m L、10^(10)cfu/m L)的***感染哺乳期BALB/c小鼠乳腺组织,观察小鼠临床症状和病理组织学变化,筛选建立小鼠乳腺纤维化模型的***感染剂量。感染小鼠后分别于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d采集小鼠乳腺组织,通过病理组织学观察、免疫组化染色、荧光定量PCR、western blot等方法,研究乳腺纤维化、TGF-β1的表达分布状况,检测TGF-β1的m RNA的转录和蛋白表达水平。结果显示108 cfu/m L ***感染哺乳期小鼠21 d时出现乳腺组织纤维化,确定其为建立小鼠乳腺纤维化模型的感染菌剂量。10~8 cfu/m L ***感染小鼠乳腺组织后,TGF-β1主要由巨噬细胞(感染后1 d、3 d、5 d)、乳腺成纤维细胞(感染后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d)及乳腺上皮细胞(感染后7 d、14 d、21 d)表达;在感染后3 d～7 d时小鼠乳腺组织中TGF-β1的表达先升高后降低,感染后14 d、21 d时其表达再次升高,并显著高于对照组(p<0.01)。本研究表明通过***感染小鼠乳腺可以建立小鼠乳腺纤维化模型,并能够促进感染后小鼠巨噬细胞、乳腺成纤维细胞、乳腺上皮细胞中TGF-β1的表达,TGF-β1在小鼠乳腺纤维化的发生发展过程中具有重要的促进作用。

关键词：金黄色葡萄球菌小鼠乳腺纤维化模型 TGF-β1

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靶向TLR2基因的siRNA对牛疱疹病毒Ⅰ型增殖规律的影响

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中国兽医科学 2016年第12期46卷 1524-1530页

作者：周伟光呼凤丽徐丽媛张志飞内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为研究牛胚胎气管（EBTr）细胞Toll样受体2（TLR2）在牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV-1）感染的天然免疫反应中的作用,本研究利用小分子干扰RNA（si RNA）技术,以TLR2为靶向设计并合成了3条si RNA干扰序列,用SYBR GreenⅠ定量PCR方法筛选出最佳的s... 详细信息

为研究牛胚胎气管（EBTr）细胞Toll样受体2（TLR2）在牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV-1）感染的天然免疫反应中的作用,本研究利用小分子干扰RNA（si RNA）技术,以TLR2为靶向设计并合成了3条si RNA干扰序列,用SYBR GreenⅠ定量PCR方法筛选出最佳的si RNA-TLR2干扰片段,继而转染EBTr细胞使其TLR2沉默后感染BHV-1,用Taq Man定量PCR方法检测BHV-1不同时间点的增殖变化。结果显示,与对照组相比转染后第48小时si TLR2A、si TLR2B和si TLR2C在EBTr细胞中分别对TLR2 m RNA表达量下调了35.05%、69.20%和84.85%,筛选出的si TLR2C片段在第12~72小时可以显著抑制TLR2 m RNA的表达（P〈0.05）,用该片段转染EBTr细胞再感染BHV-1后第6~72小时,si RNA-TLR2组BHV-1 DNA拷贝数显著低于对照组BHV-1 DNA拷贝数（P〈0.05）。本试验成功筛选出了特异性抑制EBTr细胞TLR2基因的si RNA片段,并证明抑制TLR2的表达可降低BHV-1的增殖能力。

关键词：牛疱疹病毒Ⅰ型 siRNA EBTr细胞 TLR2 定量PCR

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捻转血矛线虫GST耐药基因的克隆、表达及生物信息学分析

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中国农业大学学报 2020年第1期25卷 123-130页

作者：赵学亮孙柯苏倩呼和巴特尔王文龙内蒙古农业大学兽医学院/农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室呼和浩特010018

为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至*** BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE... 详细信息

为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至*** BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE分析蛋白表达的特征,并利用在线软件对GST蛋白进行生物信息学分析。结果表明:捻转血矛线虫GST基因大小为618 bp;诱导后的pET30a(+)-GST重组菌最佳诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG在37℃时诱导6 h,以包涵体的形式存在,大小约为29 ku。生物信息学分析表明:GST分子式为C1083H1657N277O294S6,属于不含信号肽和跨膜区的亲水性蛋白;二级结构主要由α螺旋形成;潜在的抗原表位主要位于25~48、55~63、92~106、113~124、139~147、170~189和195~205位氨基酸附近。本试验成功构建GST基因原核表达系统,优化表达条件下能稳定纯化GST重组蛋白,为进一步探索捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制及GST蛋白的生物学特性提供研究基础。

关键词：捻转血矛线虫 GST基因原核表达生物信息学

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绵羊瘤胃上皮细胞的体外分离培养、冻存及复苏方法

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中国农业大学学报 2019年第5期24卷 57-66页

作者：金鑫张曼王云鹤魏方温婧怡杨银凤内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010018 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室呼和浩特010018

本研究旨在建立绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)的分离培养、冻存和复苏方法,为反刍动物瘤胃功能的研究和相关瘤胃疾病的发病机制研究提供功能性的细胞模型。以绵羊瘤胃为研究对象,采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃... 详细信息

本研究旨在建立绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)的分离培养、冻存和复苏方法,为反刍动物瘤胃功能的研究和相关瘤胃疾病的发病机制研究提供功能性的细胞模型。以绵羊瘤胃为研究对象,采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃组织进行不同时间(40、30、20、10、10、8和5 min)的消化,并对每次消化后的瘤胃组织和消化液分别进行H.E染色分析和显微镜观察,以确定细胞开始收集及终止消化的时间,最后将收集的瘤胃上皮细胞进行原代培养。在传代培养时,运用差时消化法和差速贴壁法对ORECs进行纯化,并从细胞形态学、细胞生长曲线、角蛋白18(CK-18)免疫荧光染色和上皮细胞标志物E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶基因表达等方面对ORECs进行鉴定。然后设置不同体积配方的冻存液,将传代细胞进行冻存,通过检测复苏后的细胞活力和24 h贴壁率确定最佳冻存液配方。结果表明:第4次消化后就基本消化到瘤胃组织的棘层,此时即可开始收集细胞;第7次消化完后瘤胃上皮的基底层细胞基本被消化掉,此时即可终止消化细胞。经纯化后传代的细胞呈现均一的"铺路石"形态,生长曲线明显呈"S"形,且经CK-18免疫荧光染色后鉴定为阳性,同时PCR检测到上皮细胞特异性标志蛋白E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶均有表达。此外,ORECs经不同体积配方冻存液冻存复苏后发现,冻存液配方为V_(FBS)∶V_(DMEM)∶V_(DMSO)=9∶0∶1时ORECs的细胞活力及贴壁率最高,且传代后的细胞生长状况良好。因此本试验成功建立了ORECs的体外分离培养、冻存和复苏方法。

关键词：绵羊瘤胃上皮细胞原代培养传代培养冻存复苏

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内蒙古地区临床型奶牛子宫内膜炎葡萄球菌毒力基因检测及耐药性研究

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畜牧兽医学报 2014年第2期45卷 295-304页

作者：赵俊利李培锋李志芳关红丁月霞内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010018 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室呼和浩特010018

旨在调查引起内蒙古地区奶牛临床型子宫内膜炎致病葡萄球菌的毒力基因分布情况及其耐药现状。本试验对采集自内蒙古不同地区的260份患有临床型子宫内膜炎奶牛的子宫脓性分泌物进行了葡萄球菌的分离鉴定,调查了超抗原毒素基因(SEs和TSST... 详细信息

旨在调查引起内蒙古地区奶牛临床型子宫内膜炎致病葡萄球菌的毒力基因分布情况及其耐药现状。本试验对采集自内蒙古不同地区的260份患有临床型子宫内膜炎奶牛的子宫脓性分泌物进行了葡萄球菌的分离鉴定,调查了超抗原毒素基因(SEs和TSST-1)的分布;采用微量肉汤稀释法测定了19种抗菌药物对分离菌株的MIC,并对红霉素和四环素耐药菌株携带的相关耐药基因进行了检测。结果显示,260份样品中分离到10种127株(48.8%)葡萄球菌,其中金黄色葡萄球菌53株(41.7%),凝固酶阴性葡萄球菌74株(58.3%);80株(63.0%)葡萄球菌至少携带1种超抗原毒素基因,超抗原基因可有17种不同的组合,其中sej(38.6%)检出率最高,sec+sej+sen(33.3%)组合最为流行。分离菌株对青霉素(79.5%)和氨苄西林(71.7%)耐药率最高,对头孢菌素类的耐药率在60%左右,对大环内酯类和四环素抗生素的耐药率均在40%左右,对氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率在20%左右,对3种联合用药的抗菌药物组合耐药率均在10%左右,所有菌株均对万古霉素敏感。菌株对红霉素的耐药表型主要由ermC(46.4%)和ermB(37.5%)基因贡献,未检出ermA基因。菌株对四环素的耐药表型主要由tetK(70.0%)基因介导,其次为tetM(10.0%)基因。22株耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)均为凝固酶阴性葡萄球菌;MRS菌株对青霉素、氨苄西林、克拉霉素和红霉素的耐药率极显著高于甲氧西林敏感葡萄球菌(MSS)(P<0.01),对头孢噻肟的耐药率高于MSS(P<0.05)。结果提示:内蒙古地区临床型奶牛子宫内膜炎葡萄球菌携带毒力基因复杂,耐药情况较为严重,且发现耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌的流行。抗微生物药的耐药性可能是导致内蒙古地区奶牛临床子宫内膜炎治疗失败的主要原因之一。

关键词：奶牛子宫内膜炎葡萄球菌超抗原基因耐药性

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非洲猪瘟病毒CP204L基因的原核表达与单抗制备

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病毒学报 2021年第2期37卷 370-375页

作者：张赫杭天宇刘春羽尹坤温永俊王凤雪内蒙古农业大学兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室呼和浩特010018

由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的非洲猪瘟(ASF)给我国养猪业带来了不可估量的经济损失,严重阻碍了我国养猪业的发展,研发ASFV快速诊断试剂是目前最重要的内容之一。CP204L基因编码ASFV结构蛋白p30。本研究以克隆ASFV的CP204L基因为基础,通... 详细信息

由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的非洲猪瘟(ASF)给我国养猪业带来了不可估量的经济损失,严重阻碍了我国养猪业的发展,研发ASFV快速诊断试剂是目前最重要的内容之一。CP204L基因编码ASFV结构蛋白p30。本研究以克隆ASFV的CP204L基因为基础,通过基因重组技术,加入His标签,将构建的重组质粒命名为pET-28a-CP204L。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,37℃经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达6h,表达蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blot检测。重组蛋白纯化后免疫小鼠制备筛选单克隆抗体,Western Blot和IFA验证单抗的结合特异性。结果表明,重组的pET-28a-CP204L诱导后表达蛋白为30kD,以不可溶性包涵体形式存在;表达蛋白利用His标签进行纯化,获得纯化蛋白2mg,单克隆抗体筛选获得5株IgG亚型的ASFV p30蛋白的单抗,且均具有良好的结合活性。本研究为发展ASFV检测方法提供了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV) CP204L基因原核表达蛋白纯化单抗

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