检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2014年第6期44卷 563-568页

作者：侯成才何庆东王丽敏王先炜姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap基因中核定位序列(NLS)对Cap蛋白免疫特性的影响,以酵母偏嗜密码子优化的Cap基因为模板,采用PCR方法分别构建包含完整的和删除NLS的Cap基因的重组酵母载体,并转化至GS115宿主菌,经筛选获得GS115-pPIC9K-C... 详细信息

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap基因中核定位序列(NLS)对Cap蛋白免疫特性的影响,以酵母偏嗜密码子优化的Cap基因为模板,采用PCR方法分别构建包含完整的和删除NLS的Cap基因的重组酵母载体,并转化至GS115宿主菌,经筛选获得GS115-pPIC9K-Capo和GS115-pPIC9K-CapoΔNLS重组菌株。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,表达产物Capo和CapoΔNLS均具有Cap蛋白的抗原性,大小分别约为43ku和27ku。电镜观察结果显示,仅Capo可以形成病毒样颗粒。小鼠免疫试验结果显示,CapoΔNLS和Capo诱导的ELISA抗体水平相似,但CapoΔNLS免疫组中和抗体水平明显低于Capo组(P<0.05)。结果表明,Cap NLS对其在酵母中表达产物病毒样颗粒的形成及中和抗原特性有重要影响,从而为PCV2酵母表达亚单位疫苗的研发奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型毕赤酵母核定位序列亚单位疫苗

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TGF-β1信号通路在副猪嗜血杆菌侵入3D4/21细胞中的作用

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畜牧兽医学报 2018年第8期49卷 1720-1726页

作者：沈懿娟周妮妮张健淞王美芬李玉峰姜平南京农业大学动物医学院农业部细菌学重点开放实验室南京210095

本研究旨在探讨猪肺泡巨噬细胞传代细胞系3D4/21中转化生长因子β1(TGF-β1)表达和纤连蛋白(Fn)/α5整合素与副猪嗜血杆菌侵入的关系。通过吸附/侵入试验选择副猪嗜血杆菌最佳吸附/侵入条件;运用荧光定量PCR和ELISA方法检测副猪嗜血杆... 详细信息

本研究旨在探讨猪肺泡巨噬细胞传代细胞系3D4/21中转化生长因子β1(TGF-β1)表达和纤连蛋白(Fn)/α5整合素与副猪嗜血杆菌侵入的关系。通过吸附/侵入试验选择副猪嗜血杆菌最佳吸附/侵入条件;运用荧光定量PCR和ELISA方法检测副猪嗜血杆菌感染细胞后对TGF-β1表达的影响;用TGF-β1预处理3D4/21细胞后,用CFU检测TGF-β1表达对副猪嗜血杆菌侵入的影响;用流式细胞术检测副猪嗜血杆菌感染细胞后Fn/α5整合素表达的变化;用特异的小干扰RNA(siRNA)片段干扰Fn/α5整合素表达水平后,研究其与副猪嗜血杆菌对3D4/21吸附/侵入的影响。结果显示,副猪嗜血杆菌感染细胞后会导致TGF-β1表达增加;用重组TGF-β1预处理3D4/21细胞可以显著提高副猪嗜血杆菌的侵入水平;流式细胞术检测显示,重组TGF-β1和副猪嗜血杆菌分别处理3D4/21细胞可以增加Fn和α5整合素的表达;siRNA干扰3D4/21细胞中Fn和α5整合素的表达,细菌侵入数显著降低;然而,只有当α5整合素被干扰时,副猪嗜血杆菌的吸附数量下降。这些结果表明,TGF-β1和Fn/α5整合素的表达促进了副猪嗜血杆菌对3D4/21细胞的侵入,并在此过程中发挥重要作用。

关键词：副猪嗜血杆菌纤连蛋白(Fn) α5整合素 TGF-β1 siRNA

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猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

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中国兽医学报 2014年第10期34卷 1584-1588页

作者：王丽敏杨香林侯成才王先炜姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

为了进一步提高对猪圆环病毒2型(PCV2)检测的特异性,利用PCV2Cap蛋白及酶标记Cap单克隆抗体,建立了一种检测猪血清中PCV2Cap蛋白抗体的阻断ELISA方法,并将其组装成试剂盒。对阻断ELISA试剂盒进行了敏感性、特异性、重复性、符合率和保... 详细信息

为了进一步提高对猪圆环病毒2型(PCV2)检测的特异性,利用PCV2Cap蛋白及酶标记Cap单克隆抗体,建立了一种检测猪血清中PCV2Cap蛋白抗体的阻断ELISA方法,并将其组装成试剂盒。对阻断ELISA试剂盒进行了敏感性、特异性、重复性、符合率和保存期测定。结果显示,其敏感性高,特异性强,批内批间重复性好,与商品化试剂盒符合率高,保存期长且性质相对稳定。先后制备了5个批次的阻断ELISA试剂盒,用于检测PCV2不同疫苗免疫猪血清、规模猪场PMWS发病猪及同群健康猪血清、不同日龄猪群血清.结果显示,PCV2油佐剂免疫组血清抗体水平相对较高,PWMS发病猪血清抗体水平高于同群健康猪,猪群中育肥猪血清抗体水平最高。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白阻断ELISA

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副猪嗜血杆菌不同血清型稳定表达蛋白的筛选及间接ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2015年第1期45卷 68-74页

作者：朱晓明邹垚陈攀王丽敏李玉峰南京农业大学农业部细菌学重点开放实验室江苏南京210095

为了建立一种能够检测不同血清型副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA,选用了在4、5、12型副猪嗜血杆菌中稳定表达的3种蛋白经原核表达后作为候选抗原和全菌裂解物同时包被酶标板,对临床猪血清进行副猪嗜血杆菌抗体检测,发现以锰依赖的超氧化... 详细信息

为了建立一种能够检测不同血清型副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA,选用了在4、5、12型副猪嗜血杆菌中稳定表达的3种蛋白经原核表达后作为候选抗原和全菌裂解物同时包被酶标板,对临床猪血清进行副猪嗜血杆菌抗体检测,发现以锰依赖的超氧化物歧化酶(MSD)作为包被抗原得到的结果最接近用副猪嗜血杆菌全菌裂解物进行ELISA检测的结果,故确定以MSD蛋白为抗原建立间接ELISA。通过方阵滴定对ELISA反应条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:包被抗原的质量浓度为1.5μg/mL,4℃过夜;50g/L脱脂奶粉溶液37℃封闭2h;血清稀释度1∶160,37℃作用90min;酶标二抗的稀释度为1∶15 000,37℃作用45min;底物显色时间为37℃6min。抗体临界值D450nm≥0.245 1判为阳性,D450nm<0.208 3判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒、红斑丹毒丝菌、马链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。用建立的间接ELISA对114份临床血清进行检测,与4、5、12型全菌裂解物的ELISA检测结果比较,阳性符合率分别为80.77%、80.00%和90.00%。结果表明,建立的间接ELISA可被用于4、5、12型副猪嗜血杆菌的抗体检测和流行病学调查。

关键词：副猪嗜血杆菌 MSD重组蛋白间接ELISA

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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp4和Nsp12多克隆抗体的制备与鉴定

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中国兽医科学 2014年第6期44卷 636-640页

作者：田恬王海刘星王先炜姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)两种非结构蛋白Nsp4和Nsp12的多克隆抗体,将Nsp4基因和Nsp12基因分别克隆至pET-32a(+)和pGEX-6P-1,并转化至BL21(DE3),用IPTG诱导表达,经过Ni-NTA镍离子亲和层析和包涵体洗液纯化,获得纯化的重组... 详细信息

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)两种非结构蛋白Nsp4和Nsp12的多克隆抗体,将Nsp4基因和Nsp12基因分别克隆至pET-32a(+)和pGEX-6P-1,并转化至BL21(DE3),用IPTG诱导表达,经过Ni-NTA镍离子亲和层析和包涵体洗液纯化,获得纯化的重组蛋白,然后用它们分别免疫BALB/c小鼠制备抗血清。SDS-PAGE和Western-blot鉴定结果显示,Nsp4和Nsp12分别以可溶性蛋白和包涵体形式表达,大小分别为42ku和44ku,均具有良好的反应原性。Western-blot和IFA结果显示,制备的抗血清均与PRRSV发生特异性反应,ELISA抗体效价均可达1∶32 000。本研究结果为PRRSV Nsp4和Nsp12的生物学功能研究奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 Nsp4 Nsp12 多克隆抗体

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巴氏杆菌toxA基因的原核表达及生物学特性研究

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中国兽医科学 2018年第8期48卷 991-997页

作者：张健淞夏雨婷沈懿娟梁中洋李玉峰南京农业大学动物医学院/农业部动物细菌学重点开放实验室

为了探讨多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素（PMT）对真核细胞的致病机制,将编码PMT的tox A基因以及其N端tox N（1~1461 bp）和C端tox C（2 958~3 858 bp）分别克隆到原核表达载体p ET-32a中进行蛋白表达。3个重组蛋白在大肠杆菌中均以可溶性... 详细信息

为了探讨多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素（PMT）对真核细胞的致病机制,将编码PMT的tox A基因以及其N端tox N（1~1461 bp）和C端tox C（2 958~3 858 bp）分别克隆到原核表达载体p ET-32a中进行蛋白表达。3个重组蛋白在大肠杆菌中均以可溶性形式表达,其分子质量大小分别为176 ku、88 ku和67 ku,均能与His单克隆抗体发生特异性免疫反应。体外细胞毒性试验和豚鼠皮肤坏死试验均表明,r PMT与天然PMT具有相同的生物学功能。此外,以原核表达蛋白r PMT-N和r PMT-C分别制备的鼠多抗为一抗,对转染表达N端和C端真核质粒的Vero细胞进行IFA和Western-blot检测。结果表明,2种蛋白特异性良好,制备的多克隆抗体免疫反应条带单一。该研究的成功开展将为后续探究PMT细胞内作用机制提供可靠的生物材料。

关键词：产毒素巴氏杆菌多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素生物学活性截短表达多克隆抗体

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猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与应用

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中国兽医科学 2014年第10期44卷 1022-1028页

作者：翟淑燕陈兴慧白娟王先炜姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价... 详细信息

利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价分别为1∶6 400 000、1∶640 000和1∶800 000;亚类鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG2a亚类,轻链为κ型;Western-blot结果显示,3株单克隆抗体均能与PCV2Cap蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,3株单克隆抗体均能与感染PCV2的PK-15细胞产生特异性荧光反应;病毒中和试验显示,3E5和3E6具有中和活性。利用单克隆抗体3E5建立了检测PCV2抗原的夹心ELISA;它可被用于检测经β-丙内酯灭活的PCV2和杆状病毒表达系统表达的PCV2Cap蛋白。上述研究成果为PCV2感染的诊断和PCV2蛋白功能的研究提供了重要工具和手段。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白中和活性单克隆抗体夹心ELISA

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猪巨细胞病毒gB基因的原核表达与间接ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2013年第1期35卷 40-43页

作者：朱月华刘捷白娟宋艳华王先炜姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

猪巨细胞病毒(PCMV)是引起新生仔猪死亡、鼻炎、肺炎和生长速度减缓的重要病原之一,我国尚无有效的诊断方法。为建立检测PCMV的ELISA方法,本研究以重组PCMV囊膜糖蛋白B(gB蛋白)为包被抗原,优化反应条件:抗原包被量0.4μg/mL,待检血清稀... 详细信息

猪巨细胞病毒(PCMV)是引起新生仔猪死亡、鼻炎、肺炎和生长速度减缓的重要病原之一,我国尚无有效的诊断方法。为建立检测PCMV的ELISA方法,本研究以重组PCMV囊膜糖蛋白B(gB蛋白)为包被抗原,优化反应条件:抗原包被量0.4μg/mL,待检血清稀释度1∶100,37℃包被2 h后4℃过夜,5%脱脂乳37℃封闭2 h,二抗1∶10 000稀释,37℃作用2 h,抗体临界值为S/P≥0.354判为阳性,S/P≤0.295判为阴性,介于二者之间为可疑,建立了PCMV抗体间接ELISA检测方法。与猪瘟、猪伪狂犬病、猪附红细胞体病、副猪嗜血杆菌及猪圆环病毒2型等血清抗体无交叉反应,批间和批内重复性较好,对江苏省259份仔猪血清样品进行检测,抗体阳性率达56.76%,从而为PCMV检测和流行病学调查提供了有效方法。

关键词：猪巨细胞病毒重组囊膜糖蛋白B 原核表达间接ELISA

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猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测与ORF3基因分子流行病学调查

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中国预防兽医学报 2013年第7期35卷 555-558,561页

作者：董彦鹏白娟范宝超李玉峰姜平南京农业大学动物医学院/农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

为调查乳仔猪腹泻引起疫情的病原,本研究自2011年2月至2012年3月收集华东地区47个规模猪场共153份腹泻病料样品,采用RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV),并进行ORF3基因序列分析。结果显示:26个猪场的88份样品为PEDV阳性,猪场阳性率达到5... 详细信息

为调查乳仔猪腹泻引起疫情的病原,本研究自2011年2月至2012年3月收集华东地区47个规模猪场共153份腹泻病料样品,采用RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV),并进行ORF3基因序列分析。结果显示:26个猪场的88份样品为PEDV阳性,猪场阳性率达到55.32%,病料阳性率达到57.52%。ORF3基因测序分析显示:11个流行病毒株ORF3全基因序列大小均为675 bp,编码224个氨基酸。11个流行株ORF3基因同源性为95.9%～99.9%,编码氨基酸同源性为96.4%～100%。与欧洲代表性强毒株CV777基因同源性为96.3%～97.0%,编码氨基酸同源性为95.1%～96.4%,与CV777弱毒疫苗株基因同源性为96.8%～97.6%,编码氨基酸同源性为92.3%～93.4%,并且无疫苗病毒株ORF3基因的49个碱基缺失。与韩国病毒株比较,其基因同源性为95.0%～98.5%,编码氨基酸同源性为95.5%～99.6%。基因遗传进化树分析表明,国内外PEDV株可分为4群。我国主要流行病毒株属于第1群,与韩国病毒株亲缘关系较近,而与我国疫苗病毒株存在较大差异。该研究表明,PEDV可能是目前我国仔猪腹泻的主要病原之一,我国PEDV流行病毒株存在明显基因变异。

关键词：猪流行性腹泻病毒 RT-PCR ORF3 流行病学

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胸膜肺炎放线杆菌3种Apx毒素及外膜蛋白Omp2的原核表达及免疫反应性鉴定

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畜牧与兽医 2019年第5期51卷 89-93页

作者：万玉萌安家慧纪玉洁郑瑞程李玉峰南京农业大学/农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

猪传染性胸膜肺炎是猪群一种常见的细菌性疾病,给养猪业造成了巨大的经济损失。为了对胸膜肺炎放线杆菌的感染情况进行监测,本研究设计了针对该菌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和外膜蛋白Omp2的全基因PCR扩增引物,以实验室保存的血清2型和5... 详细信息

猪传染性胸膜肺炎是猪群一种常见的细菌性疾病,给养猪业造成了巨大的经济损失。为了对胸膜肺炎放线杆菌的感染情况进行监测,本研究设计了针对该菌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和外膜蛋白Omp2的全基因PCR扩增引物,以实验室保存的血清2型和5型菌株基因组DNA作为模板成功扩增出特异性基因片段,分别将目的片段克隆入原核表达载体成功构建重组表达质粒pColdI-omp2、pColdI-ApxⅡ、pET-32am-ApxⅠ、pCold-ProS2-ApxⅢ。将重组质粒转化Rosetta感受态细胞,通过IPTG诱导表达,应用His单克隆抗体和临床阳性猪血清对表达的重组蛋白上清进行Western blot分析,结果表明表达蛋白的分子量大小与预期相符,通过诱导条件的优化可以稳定表达可溶性蛋白,可溶性蛋白能与His单克隆抗体和临床阳性猪血清发生特异性反应,证明重组蛋白具有良好的免疫反应性。该试验为后期建立胸膜肺炎放线杆菌抗体的ELISA检测方法奠定基础。

关键词：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 ApxI ApxⅡ ApxⅢ Omp2 原核表达

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