检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧与兽医 2014年第2期46卷 1-5页

作者：陈兴慧白娟王先炜李玉峰姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

利用纯化灭活的猪源脑心肌炎病毒(EMCV)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,研制获得4株能稳定分泌抗EMCV抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D1、2A2、2B6和4E2。经ELISA测定,细胞培养上清中抗体效价分别为1∶1 600,1∶6 400,1∶6 400和1∶... 详细信息

利用纯化灭活的猪源脑心肌炎病毒(EMCV)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,研制获得4株能稳定分泌抗EMCV抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D1、2A2、2B6和4E2。经ELISA测定,细胞培养上清中抗体效价分别为1∶1 600,1∶6 400,1∶6 400和1∶3 200,小鼠腹水抗体效价分别为1∶1.63×106,1∶3.28×106,1∶1.13×106和1∶5.63×105。1D1和2A2单抗亚类为IgG1,2B6和4E2单抗亚类为IgG2b,轻链均为κ型。Western blot结果表明,1D1、2A2和4E2能特异性识别病毒的VP1蛋白,2B6能特异性识别病毒的VP2蛋白。间接免疫荧光试验证明,4株单抗具有良好的特异性,均能识别EMCV。本研究获得的4株特异性单抗,将为EMCV诊断方法的建立和病毒蛋白功能的研究奠定基础。

关键词：脑心肌炎病毒单克隆抗体免疫荧光试验

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我国部分省份猪嗜血支原体感染血清流行病学调查

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畜牧与兽医 2013年第11期45卷 82-84页

作者：程王琨侯成才常晨李玉峰南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

为研究猪嗜血支原体在猪群中的感染情况,本研究采用阻断ELISA方法对来自我国7个省(区)的1 492份猪血清进行了检测,并对其感染的时间、空间和种群间的分布进行了分析。结果表明:血清总阳性率为17.36%,其中上海地区最高为57.01%,广西地区... 详细信息

为研究猪嗜血支原体在猪群中的感染情况,本研究采用阻断ELISA方法对来自我国7个省(区)的1 492份猪血清进行了检测,并对其感染的时间、空间和种群间的分布进行了分析。结果表明:血清总阳性率为17.36%,其中上海地区最高为57.01%,广西地区最低为4.55%,安徽、浙江、江苏、江西和四川分别为28.40%、20.25%、13.93%、7.14%和5.49%。感染时间从6、7月份开始,9月份感染比例达到最高(33.94%),然后开始慢慢下降。种群间分析显示,母猪血清阳性率为65.48%,仔猪为4.8%。血清流行病学调查结果显示猪嗜血支原体在我国猪群的感染比较普遍,而且呈现出逐年增加的趋势,应该引起足够的重视。

关键词：猪嗜血支原体阻断ELISA 血清流行病学调查

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猪流行性腹泻病毒M和S蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

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畜牧与兽医 2014年第5期46卷 35-40页

作者：郑芳园陈攀范宝超李玉峰南京农业大学农业部细菌学重点开放实验室江苏南京210095

采用PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白和S蛋白基因的亲水区进行扩增,扩增片段(命名为Ma和Sa)分别克隆至原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1中,获得的重组质粒pET-32a-Ma和pGEX-6p-1-Sa转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后进行SDS-P... 详细信息

采用PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白和S蛋白基因的亲水区进行扩增,扩增片段(命名为Ma和Sa)分别克隆至原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1中,获得的重组质粒pET-32a-Ma和pGEX-6p-1-Sa转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。表达产物经SDS-PAGE后切胶免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清效价,Westernblot和间接免疫荧光方法检测抗体的特异性。结果表明目标蛋白获得了正确表达,且制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。PEDV Ma和Sa蛋白的表达及多克隆抗体的制备将为进一步构建PEDV的病毒样颗粒(VLP)抗原和建立血清学检测方法奠定基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 M蛋白 S蛋白原核表达多克隆抗体

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副猪嗜血杆菌抗原抗体复合物疫苗对小鼠免疫保护效果的评价

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中国兽医科学 2021年第8期51卷 1015-1022页

作者：祝可心于栋安家慧李玉峰南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

为评价副猪嗜血杆菌标准血清5型菌株(HPS-5)抗原抗体复合物疫苗对小鼠的免疫保护效果,选用40只ICR小鼠,随机分为5组(每组8只),分别设为灭活疫苗组、抗原抗体复合物疫苗组、阴性对照组、攻毒对照组和空白组。将制备的疫苗接种小鼠,在首... 详细信息

为评价副猪嗜血杆菌标准血清5型菌株(HPS-5)抗原抗体复合物疫苗对小鼠的免疫保护效果,选用40只ICR小鼠,随机分为5组(每组8只),分别设为灭活疫苗组、抗原抗体复合物疫苗组、阴性对照组、攻毒对照组和空白组。将制备的疫苗接种小鼠,在首次免疫前、首次免疫2周后、二次免疫2周后分别采集小鼠血清通过间接ELISA方法检测抗体水平。二次免疫2周后,每组随机取3只小鼠分离外周血淋巴细胞并提取总RNA进行反转录,通过SYBR Green实时荧光定量PCR方法检测小鼠细胞因子水平。随后,用HPS-5攻毒,观察7 d,计算免疫保护率。取每组小鼠的肺和脾,制作病理切片后置于显微镜下观察。结果显示:抗原抗体复合物疫苗组刺激小鼠产生的TNF-α、IL-6、IFN-γ细胞因子水平与灭活疫苗组、阴性对照组相当(P>0.05),IL-10细胞因子水平显著低于这两组(P<0.05)。抗原抗体复合物疫苗组的D_(450,IgG2a)/D_(450,IgG1)值(0.76)显著高于灭活疫苗组(0.54)和阴性对照组(0.55)(P<0.01)。灭活疫苗组与抗原抗体复合物疫苗组小鼠的存活率均为60%,病理切片结果显示,抗原抗体复合物疫苗组对肺、脾的保护作用略优于灭活疫苗组。以上结果提示,制备的抗原抗体复合物疫苗可能通过下调Th2型反应从而维持Th1/Th2型免疫反应平衡,同时可以降低小鼠机体的炎性反应,具有较好的免疫保护效果,为研究抗原抗体复合物疫苗预防副猪嗜血杆菌感染奠定了理论基础。

关键词：副猪嗜血杆菌抗原抗体复合物疫苗 Th1/Th2平衡存活率病理变化

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1株猪丹毒杆菌的分离与鉴定

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畜牧与兽医 2015年第2期47卷 11-14页

作者：邹垚朱晓明苑文涛张亚宁夏雨婷李玉峰南京农业大学农业部细菌学重点开放实验室江苏南京210095

为确定导致安徽和县某猪场猪只发病的病原,从该猪场送检病料(心、肺、脾、肝)中分离并纯化细菌,根据其形态特征、PCR鉴定及生化试验结果,确诊为猪丹毒杆菌。spa A基因序列分析结果显示该菌与猪丹毒杆菌G4T10(Gen Bank登录号:KF150604.1)... 详细信息

为确定导致安徽和县某猪场猪只发病的病原,从该猪场送检病料(心、肺、脾、肝)中分离并纯化细菌,根据其形态特征、PCR鉴定及生化试验结果,确诊为猪丹毒杆菌。spa A基因序列分析结果显示该菌与猪丹毒杆菌G4T10(Gen Bank登录号:KF150604.1)有99%的同源性。全自动生化反应报告该菌为丹毒丝菌的概率高达95%。小鼠攻毒试验表明,试验组小鼠在腹股沟皮下注射该菌后,4 d内全部死亡;死亡小鼠剖检可见全身败血性出血,各脏器均有病变,从死亡小鼠的血液、心、肝、脾、肺等组织中分离到与该感染菌株形态特征完全一致的细菌。药敏试验结果表明,该菌对β-内酰胺类和大环内酯类抗生素敏感,对链霉素、卡那霉素、四环素、多西环素、林可霉素和磺胺异恶唑耐受。

关键词：急性猪丹毒猪丹毒杆菌分离鉴定

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猪繁殖与呼吸综合征病毒截短GP5蛋白间接ELISA方法的建立

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畜牧与兽医 2014年第4期46卷 36-40页

作者：陈攀郑芳园李玉峰南京农业大学农业部细菌学重点开放实验室江苏南京210095

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染主要引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状,目前尚无有效的血清学检测方法评价猪群疫苗免疫或感染后抗体水平与免疫保护力之间的关系。为建立PRRSV GP5蛋白的ELISA方法,本研究选择GP5蛋白亲水区进行... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染主要引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状,目前尚无有效的血清学检测方法评价猪群疫苗免疫或感染后抗体水平与免疫保护力之间的关系。为建立PRRSV GP5蛋白的ELISA方法,本研究选择GP5蛋白亲水区进行原核表达,以表达的重组蛋白tGP5为包被抗原建立了检测针对GP5蛋白抗体的ELISA方法,优化后反应条件为:抗原包被浓度2μg/mL,37℃包被2 h,5%脱脂乳37℃封闭2 h,待检血清稀释度1∶100,37℃作用1 h,二抗1∶20 000稀释,37℃作用45 min,37℃显色3 min,抗体临界值OD450nm≥0.22判为阳性,OD450nm<0.183判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。

关键词： PRRSV 重组蛋白tGP5 原核表达间接ELISA

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猪丹毒杆菌噬菌体裂解酶的原核表达及活性检测

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畜牧与兽医 2016年第10期48卷 37-40页

作者：苑文涛张亚宁夏雨婷李玉峰南京农业大学农业部细菌学重点开放实验室江苏南京210095

根据猪丹毒杆菌噬菌体基因测序结果,设计针对裂解酶(Ely)的特异性扩增引物,PCR扩增获得Ely产物,PCR产物经酶切后克隆入表达载体p ET-28a(+),获得重组质粒p ET-28a(+)-Ely,并转化至大肠杆菌BL21(Rosetta)中。以1mmol/L IPTG在28℃诱导8 h... 详细信息

根据猪丹毒杆菌噬菌体基因测序结果,设计针对裂解酶(Ely)的特异性扩增引物,PCR扩增获得Ely产物,PCR产物经酶切后克隆入表达载体p ET-28a(+),获得重组质粒p ET-28a(+)-Ely,并转化至大肠杆菌BL21(Rosetta)中。以1mmol/L IPTG在28℃诱导8 h,SDSPAGE结果表明,蛋白在上清中高效表达;通过Ni2+-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,其纯度在90%以上;以100、10和1μg/m L的终浓度作用于猪丹毒杆菌培养物,每隔1 h进行一次菌落计数,直至7 h,结果表明该裂解酶在体外可以有效裂解猪丹毒杆菌,并呈一定的时间和剂量依赖性。该研究将为治疗耐药性猪丹毒杆菌感染提供新的思路。

关键词：猪丹毒杆菌噬菌体裂解酶表达活性

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副猪嗜血杆菌4种疑似毒力因子多克隆抗体的制备与鉴定

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畜牧与兽医 2017年第4期49卷 69-73页

作者：夏雨婷张健淞沈懿娟梁中洋李玉峰南京农业大学动物医学院/农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

在利用蛋白质非标记定量技术(Lable-free)分析副猪嗜血杆菌强毒株与无毒株差异蛋白的基础上,筛选出4种疑似毒力因子,通过基因扩增后克隆入原核表达载体p ET-32a,构建重组质粒,转入Rosetta菌株后成功表达了目标蛋白。重组蛋白经亲和层析... 详细信息

在利用蛋白质非标记定量技术(Lable-free)分析副猪嗜血杆菌强毒株与无毒株差异蛋白的基础上,筛选出4种疑似毒力因子,通过基因扩增后克隆入原核表达载体p ET-32a,构建重组质粒,转入Rosetta菌株后成功表达了目标蛋白。重组蛋白经亲和层析纯化后免疫小鼠,制备多克隆抗体,并将其与菌体蛋白进行Western blot验证。结果表明,表达的4种蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体免疫反应条带单一。该研究为从蛋白水平上探讨副猪嗜血杆菌毒力因子的功能奠定了基础。

关键词：副猪嗜血杆菌毒力因子多克隆抗体特性

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日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白编码基因的克隆和表达

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第3期34卷 311-317页

作者：金亚美林矫矫冯新港张亮吴祥甫周元聪蔡幼民中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所、农业部动物寄生虫学重点开放实验室

根据曼氏血吸虫抱雌沟蛋白基因SmGcp序列和日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区的基因片段SjGcp1分别设计三对引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板 ,用RT PCR法扩增出大小为 1949bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段含编码日本... 详细信息

根据曼氏血吸虫抱雌沟蛋白基因SmGcp序列和日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区的基因片段SjGcp1分别设计三对引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板 ,用RT PCR法扩增出大小为 1949bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段含编码日本血吸虫抱雌沟蛋白基因的完整阅读框 ,与SmGcp碱基一致性为 85 % ,其理论推测氨基酸组成与曼氏血吸虫抱雌沟蛋白的一致性为 83.7%。将上述扩增的基因片段克隆到表达载体pET2 8c(+)中 ,在大肠杆菌BL2 1中获得表达 ,融合表达产物分子量约为 80kD。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测 ,在预测位置出现了明显的识别条带 ,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性

关键词：日本血吸虫抱雌沟蛋白基因克隆基因表达

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抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用

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中国农业科学 2010年第12期43卷 2584-2589页

作者：职爱民李青梅刘庆堂刘宣兵杨继飞杨苏珍柴书军杨艳艳邓瑞广张改平河南省农业科学院/农业部动物免疫学重点开放实验室

【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE... 详细信息

【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ***-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ***-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。

关键词：庆大霉素单克隆抗体杂交瘤初步应用

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