目的基于网络药理学,通过分子对接技术及体外实验验证,探讨蒲黄治疗神经病理性疼痛的核心成分及其作用机制。方法第一步:网络药理学分析及分子对接。首先通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)数据库检索蒲黄的活性成分及其主要作用靶点、Gene Cards数据库及在线人类孟德尔遗传(OMIM)和提取神经病理性疼痛相关的靶点。利用Venny平台获取两者的交集靶点,再利用STRING平台和Cytoscape软件构建二者共同靶点的蛋白相互作用网络;其次运用DAVID和Bioconductor数据库开展生物过程富集分析和通路富集分析,运用Cytoscape软件构建“活性成分-靶点-通路”网络;最后使用Auto Dock Vina软件完成分子对接验证有效成分与关键作用靶点的结合度。第二步:培养BV2细胞进行体外实验验证。首先进行CCK-8法筛选蒲黄有效成分槲皮素(quercetin,Que)药物浓度对BV2细胞影响;然后根据CCK-8结果,将BV2细胞随机分为对照(Control)组、LPS组、(高、中、低)浓度Que+LPS组。对照组加入DMEM培养液作为对照;LPS组加入1ug/ml的LPS;高、中、低浓度Que+LPS组细胞分别用100u M、50u M和25u M的Que预保护2h,再加入1ug/ml的LPS继续培养24h,利用实时定量PCR(RT-q PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)对关键靶点IL-6、TNF-α、IL-17及CCL2进行验证。结果网络药理学分析结果共获得蒲黄活性成分6个,其中槲皮素为靶点数最多的成分;蒲黄与神经病理性疼痛的共同靶点77个,PPI网络结果显示IL-6为核心靶点;富集分析结果共涉及生物过程123种、信号通路163条,其中涉及主要生物过程为细胞因子受体结合、以及IL-6为主要因子的IL-17信号通路;分子对接结果显示核心成分槲皮素与血管内皮生长因子A(VEGFA)有较高的结合活性。通过网络药理学分析结果,体外实验选择槲皮素作用于脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠BV2小胶质细胞炎症模型进行核心靶点和通路的初步验证,得出如下结果:与Control组比较,LPS组显著上调IL-6、IL-17、TNF-α和CCL2的m RNA水平,差异均有统计学意义(P<0.01);与LPS组相比,低、中、高剂量实验组的IL-6、TNF-α和CCL2 m RNA相对表达量均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与LPS组相比,中、高剂量实验组的IL-17 m RNA相对表达量均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。ELISA结果显示:与Control组相比,LPS组TNF-α、IL-17、IL-6的相对浓度显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与LPS组相比,低、中、高剂量实验组的TNF-α、IL-6的相对浓度均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与LPS组相比,中、高剂量实验组IL-17的相对浓度显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论1.本研究利用网络药理学筛选出蒲黄缓解NP的主要活性成分为槲皮素、主要作用靶点为IL-6,为蒲黄治疗神经病理性疼痛的作用机制提供了理论基础;2.通过RT-q PCR、ELISA实验初步验证了蒲黄有效成分槲皮素可明显降低LPS诱导的BV2细胞的炎性因子的表达与分泌,这为蒲黄治疗神经病理性疼痛的作用机制提供了新的思路。
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