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动物学杂志 2019年第3期54卷 445-450页

作者：黎晓慧李明学黄鑫张志成袁圆代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 昆明医科大学中国医学科学院医学生物学研究所昆明650500

本文旨在建立树鼩(Tupaia belangeri)小胶质细胞原代培养及纯化的方法,为利用新型实验动物树鼩进行相关研究工作提供实验材料。将新生树鼩大脑皮质机械分离,皮质组织块用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液;培养9～10 d后,分别采用直立手拍法... 详细信息

本文旨在建立树鼩(Tupaia belangeri)小胶质细胞原代培养及纯化的方法,为利用新型实验动物树鼩进行相关研究工作提供实验材料。将新生树鼩大脑皮质机械分离,皮质组织块用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液;培养9～10 d后,分别采用直立手拍法、温和胰酶消化法以及恒温振荡法分离纯化树鼩小胶质细胞,通过差速贴壁进一步纯化。荧光显微镜下,利用小胶质细胞的特异性标记物CD11b抗体进行鉴定。结果显示,小胶质细胞分离培养第3天时呈静息状态,表现为梭形、杆状、分支状等不规则形态。细胞免疫荧光CD11b呈阳性。不同纯化方法细胞免疫荧光并计数显示,直立手拍法所获得的细胞产量明显高于恒温振荡法(P <0.05),细胞阳性率(> 96%)明显高于温和胰酶消化法(> 90%,P <0.05)。直立手拍法可获得产量及纯度高的树鼩原代小胶质细胞。

关键词：树鼩原代小胶质细胞直立手拍法温和胰酶消化法恒温振荡法

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易发生聚集的重组HBcAg病毒样颗粒的纯化

易发生聚集的重组HBcAg病毒样颗粒的纯化

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第22届中国科协年会--公共卫生安全与生物技术论坛

作者：谢航航白红妹叶超陈永俊袁明翠马雁冰中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明 650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明 650118

目的：探索针对易发生聚集的重组HBcAg病毒样颗粒(VLP)的有效纯化方案。方法：培养的大肠杆菌经IPTG诱导重组HBcAg蛋白的表达,菌体超声破碎后的离心沉淀用含有不同浓度尿素的PBS缓冲液重悬溶解,经密度梯度离心并结合电镜观察对 VLPs 行... 详细信息

目的：探索针对易发生聚集的重组HBcAg病毒样颗粒(VLP)的有效纯化方案。方法：培养的大肠杆菌经IPTG诱导重组HBcAg蛋白的表达,菌体超声破碎后的离心沉淀用含有不同浓度尿素的PBS缓冲液重悬溶解,经密度梯度离心并结合电镜观察对 VLPs 行为进行分析鉴定。以Sepharose 4 FF凝胶过滤层析在选定的尿素条件下纯化沉淀溶解液,纯化获得的目的蛋白进一步在含30%山梨醇的PBS中脱盐去除尿素。整个过程以SDS-PAGE及电镜进行各步骤样品中目的蛋白的分析。结果：含有 1 mol/L尿素的PBS缓冲溶液重悬超声沉淀,可有效溶解聚集的VLPs,在蔗糖密度梯度离心中显示典型HBcAg VLPs的行为,且电镜观察颗粒形态结构完整。经 1 mol/L尿素下凝胶过滤,VLPs进一步获得纯化。在脱尿素过程中流动相采用含30％山梨醇的PBS,有效避免了VLPs在尿素去除后重新聚集。结论：尿素与山梨醇的联合应用,为具有聚集现象的VLPs纯化制备提供了一种有效解决方案。

关键词：病毒样颗粒纯化聚集尿素山梨醇

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2022年昆明市4株柯萨奇病毒A组6型全基因组特征分析

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中国病毒病杂志 2024年第6期14卷 547-554页

作者：陈俊薇冯昌增楚昭阳刘煜菡张名李丽马绍辉云南大学生命科学学院云南昆明650504 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所、云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明市妇幼保健院检验科云南昆明650031

目的对4株2022年云南省手足口病监测中鉴定出的CVA6病毒分离株(coxsackievirus A6,CVA6)进行全基因组序列和遗传进化分析,为CVA6的流行病学和疾病防控提供基础数据。方法采用人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma cells,RD细胞)对4... 详细信息

目的对4株2022年云南省手足口病监测中鉴定出的CVA6病毒分离株(coxsackievirus A6,CVA6)进行全基因组序列和遗传进化分析,为CVA6的流行病学和疾病防控提供基础数据。方法采用人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma cells,RD细胞)对4株云南CVA6病毒分离株进行病毒增殖,收获增殖病毒。提取病毒RNA,应用反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RTPCR)扩增其VP1(viral protein 1,VP1)序列,并由昆明擎科生物科技公司完成VP1序列测定,利用NCBI在线网站BLAST比对鉴定其血清型。设计针对CVA6全基因组各片段的引物,分段扩增序列并测序获得各段序列,使用DNAStar 7.1软件中的SeqMan拼接序列,采用Mega 7.0、Simplot 3.5.1等软件对其全基因组序列和基因重组进行分析。结果4株云南CVA6病毒分离株全基因组核苷酸和氨基酸序列一致性分别为96.83%~98.38%和98.73%~99.36%,均属于在中国内地近年流行的优势基因型D3基因亚型中的D3a分支。4株云南CVA6病毒分离株在非结构区与肠道病毒A114型(enterovirus A114,EV-A114)原型株V13-0285、柯萨奇A组5型(coxsackievirus A5,CVA5)原型株Swartz、CVA16原型株G-10、CVA4原型株High Point、CVA14原型株G-14聚类在一起。结论4株CVA6病毒分离株在非结构区与其他肠道病毒A组血清型原型株之间可能有重组事件发生,4株云南CVA6病毒分离株均属于中国内地流行的优势基因型D3a,近几年云南地区的CVA6流行株传播可能为多条传播链共循环。

关键词：柯萨奇病毒A组6型云南株全基因组序列系统进化分析重组分析

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云南省柯萨奇病毒A组10型的全基因组分析

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昆明医科大学学报 2025年第2期46卷 23-29页

作者：楚昭阳李佳玲陈俊薇冯昌增张名李丽马绍辉中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明医科大学海源学院云南昆明650106 云南大学生命科学学院云南昆明650504 昆明市妇幼保健院检验科云南昆明650031

目的分析从2022年手足口病患儿粪便样品中分离到的柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CVA10)分离株的全基因组特征。方法经人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma,RD)分离得到该分离株,将其命名为155/YN/CHN/2022。提取病毒RNA,... 详细信息

目的分析从2022年手足口病患儿粪便样品中分离到的柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CVA10)分离株的全基因组特征。方法经人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma,RD)分离得到该分离株,将其命名为155/YN/CHN/2022。提取病毒RNA,采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增其VP1序列,鉴定血清型。然后分段全基组扩增并拼接155/YN/CHN/2022的全基因组序列,利用MEGA7.0、DNAStar7.1和Simplot3.5.1等软件对序列进行分析。结果CVA10分离株155/YN/CHN/2022经扩增及拼接后得到的全基因组序列长为7403 nt,其中5'UTR区为746 nt,3'UTR区为76 nt,编码区长6552 nt,该分离株与CVA10原型株的核苷酸序列和氨基酸序列一致性分别为78.43%和95.30%,而与其他国内外CVA10分离株的核苷酸序列和氨基酸序列一致性分别为91.18%~95.06%和97.63%~98.54%。系统发育分析发现,155/YN/CHN/2022位于C基因型。P1、P2、P3系统发育结果显示,在P2、P3非编码区,该分离株与其他血清型毒株可能发生过重组。Simplot重组分析也显示,CVA10分离株155/YN/CHN/2022可能在非编码区出现重组事件。结论CVA10分离株155/YN/CHN/2022属于C基因型,和近年来中国大陆流行株属于同一基因型。

关键词：手足口病柯萨奇病毒A组10型全基因组进化分析

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抗树鼩CD4单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定

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中国生物制品学杂志 2019年第10期32卷 1097-1101,1107页

作者：吴忠香张雪梅徐婧雯宋杰李慧朱文兵蒋曦李卫宇董少忠中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队云南昆明650118

目的制备鼠抗树鼩CD4单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法将重组质粒pGEX-5X-1-CD4和pET30a(+)-CD4分别转化感受态*** BL21和BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并通过Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱纯化重组蛋白GST-CD4和His-CD4。以His-CD4蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术筛选出能分泌抗树鼩CD4的杂交瘤细胞株,制备小鼠腹水单克隆抗体,间接ELISA法检测效价,并通过Protein A亲和层析柱纯化获得鼠抗树鼩CD4单克隆抗体,Western blot及FACS法分析其生物学特性。结果筛选出3株能稳定分泌抗树鼩CD4单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为37D2、38E1、39F2,腹水单克隆抗体效价分别为1∶204800、1∶204800、1∶3200。经HRP标记的38E1单克隆抗体可与树鼩PBMC总蛋白发生特异性结合,经PECy5.5标记的38E1单克隆抗体能特异性识别树鼩PBMC。结论成功制备了鼠抗树鼩CD4的单克隆抗体,为进一步对树鼩作为动物模型的研究及应用奠定了基础。

关键词：树鼩 CD4 单克隆抗体生物学特性

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单纯疱疹病毒Ⅰ型基因突变株M3株与水痘带状疱疹病毒减毒活疫苗Oka株感染小鼠的生物学特性比较

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中国生物制品学杂志 2019年第3期32卷 249-254页

作者：柳蕾徐兴丽冯敏何玉凤王丽春张莹李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明医科大学云南昆明650500

目的比较单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus typeⅠ,HSV-Ⅰ)基因突变株M3株与水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)减毒活疫苗Oka株感染BALB/c小鼠的生物学特性。方法用不同剂量(103、104、105 PFU/只)的HSV-ⅠM3株及疫... 详细信息

目的比较单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus typeⅠ,HSV-Ⅰ)基因突变株M3株与水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)减毒活疫苗Oka株感染BALB/c小鼠的生物学特性。方法用不同剂量(103、104、105 PFU/只)的HSV-ⅠM3株及疫苗剂量的VZV Oka株以不同方式(腹腔、肌肉、鼻腔、足垫)感染小鼠后,对小鼠的急性临床反应、体重变化、病毒增殖、组织病理损伤及病毒重激活等生物学特性进行比较。结果 HSV-ⅠM3及VZV Oka组小鼠均未见弓背、倒毛、单侧眼失明等急性临床症状,体重均呈逐渐上升趋势;器官组织中病毒拷贝数均处于较低水平,且两组差异无统计学意义(P> 0. 05);小鼠脑组织出现轻微局部炎症细胞浸润、出血、胶质小结或无异常,两组差异较小,脊髓组织均未出现明显异常;神经组织与Vero细胞共培养,均未观察到细胞病变(CPE)。结论 HSV-ⅠM3株与VZV Oka株感染小鼠后的生物学特征无明显差异。

关键词：单纯疱疹病毒Ⅰ型突变株水痘带状疱疹病毒减毒活疫苗小鼠生物学特性

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云南省汉族人群LMP基因多态性与结核病易感性的关联性研究

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贵州医科大学学报 2020年第5期45卷 512-519页

作者：刘楠楠刘舒媛王辉张新文李传印史荔张淑琼中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所&云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明市第三人民医院云南昆明650118

目的:研究云南省汉族人群LMP2、LMP7基因单核苷酸多态性(SNP)与结核病(TB)的相关性。方法:选取449例云南省汉族TB患者(其中肺TB 324例、肺外TB 125例)作为病例组,367例健康人群作为对照组;采用SNaPshot分型法对LMP 2基因的3个SNP位点rs1... 详细信息

目的:研究云南省汉族人群LMP2、LMP7基因单核苷酸多态性(SNP)与结核病(TB)的相关性。方法:选取449例云南省汉族TB患者(其中肺TB 324例、肺外TB 125例)作为病例组,367例健康人群作为对照组;采用SNaPshot分型法对LMP 2基因的3个SNP位点rs1351383(T>G)、rs17587(C>T)、rs2127675(A>G)和LMP 7基因的rs2071543(G>T)位点进行基因分型,比较这4个SNP位点等位基因和基因型在病例组和对照组中的频率,结合遗传模式分析和单倍型分析,研究LMP 2和LMP 7基因SNP多态性与TB的相关性。结果:经Bonferroni校正后,4个SNP位点的等位基因及基因型频率在病例组和对照组中差异均无统计学意义(P>0.0125);但在分层研究中,rs1351383位点的C等位基因在肺外TB患者中的频率显著高于对照组(P=0.010,OR=1.377,95%CI为1.030~1.841),加性遗传模式分析显示该位点基因型在病例组和对照组间频率的差异具有统计学意义(P=0.008,OR=1.520,95%CI为1.120~2.080);rs1351383-rs17587-rs2127675-rs2071543单倍型C-G-G-G在肺外TB患者中的频率显著高于对照组(P=0.003,OR=1.982,95%CI为1.246~3.154)。结论:云南省汉族人群中LMP基因的多态位点rs1351383的C等位基因及其rs1351383-rs17587-rs2127675-rs2071543单倍型C-G-G-G可能增加肺外TB的患病风险。

关键词：多态性,单核苷酸低相对分子量蛋白酶体基因结核病云南汉族

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CA16感染树鼩肺成纤维细胞模型的建立及其受体SCARB2的表达

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中国实验动物学报 2019年第4期27卷 479-484页

作者：王文广匡德宣李娜陆彩霞罕园园仝品芬孙晓梅代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队

目的探讨建立CA16感染树鼩肺成纤维细胞(tree shrew lung fibroblasts,TSLF)实验模型的可行性。方法用肠道病毒CA16感染TSLF,以人肺成纤维细胞(KMB-17)作对照,镜下观察细胞病变情况,间接免疫荧光实验观察病毒蛋白和感染相关受体SCARB... 详细信息

目的探讨建立CA16感染树鼩肺成纤维细胞(tree shrew lung fibroblasts,TSLF)实验模型的可行性。方法用肠道病毒CA16感染TSLF,以人肺成纤维细胞(KMB-17)作对照,镜下观察细胞病变情况,间接免疫荧光实验观察病毒蛋白和感染相关受体SCARB2蛋白的表达情况,探针法实时荧光定量PCR检测病毒载量,以β-Actin作内参染料法实时荧光定量PCR检测受体SCARB2基因的相对表达量,结合基因序列比对,分析其与感染的相关性。结果 CA16感染TSLF,可引起明显的细胞病变,免疫荧光实验可见病毒和受体SCARB2蛋白,以100TCID50/10^5 cells的比例感染TSLF可在48 h左右病毒载量达到最高,SCARB2基因有与感染相关的高表达,而其基因序列也与人有较高同源性。结论 CA16可感染TSLF,树鼩SCARB2可参与感染。

关键词： CA16 树鼩肺成纤维细胞感染 SCARB2

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树鼩的标准化研究与应用进展

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实验动物科学 2020年第1期37卷 74-78页

作者：王文广匡德宣仝品芬李娜陆彩霞罕园园孙晓梅代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心、云南省重大传染病疫苗研发重点实验室、云南省眼科疾病防治研究重点实验室、中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队昆明650118

树鼩是我国正在开发的新型实验动物,与人类有较近的亲缘关系,其许多生物学特性也与人类近似,在生命科学研究领域应用广泛。建立树鼩人工种群并开展标准化研究,是实现树鼩实验动物化的重要保证,本文就树鼩的标准化建设工作和应用情况进... 详细信息

树鼩是我国正在开发的新型实验动物,与人类有较近的亲缘关系,其许多生物学特性也与人类近似,在生命科学研究领域应用广泛。建立树鼩人工种群并开展标准化研究,是实现树鼩实验动物化的重要保证,本文就树鼩的标准化建设工作和应用情况进行简要概述。

关键词：树鼩标准化应用

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二磷酸氯喹对THP-1细胞增殖及凋亡的影响

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中国生物制品学杂志 2019年第4期32卷 386-389页

作者：洪珊杨佳佳文送娇林垚叶超孙强明昆明医科大学云南昆明650500 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 赣南医学院基础医学院江西赣州341000

目的探讨不同浓度二磷酸氯喹对急性单核细胞性白血病细胞THP-1增殖及凋亡的影响。方法分别用10、20、40、80、100μmol/L氯喹处理THP-1细胞,分别于处理12、24、48和72 h收集细胞,MTS法检测细胞增殖情况,同时采用Hoechst33342荧光染色法... 详细信息

目的探讨不同浓度二磷酸氯喹对急性单核细胞性白血病细胞THP-1增殖及凋亡的影响。方法分别用10、20、40、80、100μmol/L氯喹处理THP-1细胞,分别于处理12、24、48和72 h收集细胞,MTS法检测细胞增殖情况,同时采用Hoechst33342荧光染色法及流式细胞仪检测二磷酸氯喹对THP-1细胞凋亡的影响。结果处理细胞12、24 h时,10、20、40、80、100μmol/L二磷酸氯喹对细胞增殖无明显影响,各组间差异无统计学意义(P>0.05);处理细胞48、72 h时,各浓度二磷酸氯喹对细胞增殖均有抑制作用,细胞活力均明显下降,各组间差异有统计学意义(P<0.01),并具有剂量依赖性。不同浓度二磷酸氯喹对THP-1细胞凋亡均具有诱导作用,且随着浓度的增加,细胞凋亡愈加明显。结论二磷酸氯喹在体外可抑制THP-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,其作用具有剂量依赖性。

关键词：二磷酸氯喹 THP-1细胞细胞增殖细胞凋亡

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