目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定...
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目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100copies/μL,PCR扩增效率达到99.5%。结论 SYBRGreenⅠ荧光染料实时定量PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA载量的定量测定。
目的建立全身表达24-脱氢胆固醇还原酶基因(Dhcr24)转基因小鼠动物模型,研究该基因过表达对小鼠代谢的影响。方法RT-PCR法克隆小鼠Dhcr24基因,把该基因插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立Dhcr24转基因小鼠。PCR鉴定Dhcr24转基因小鼠的基因型,RT-PCR和Western Blot检测基因表达水平,血生化检测仪检测转基因小鼠血生化指标的改变。结果建立了2个不同表达水平的Dhcr24转基因小鼠品系,转入的Dhcr24基因在肝和脾组织中的表达高于内源的Dhcr24。血生化检测证实:乳酸脱氢酶(LDH)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)和血肌酐(SCr)较野生型小鼠明显降低,而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)和碱性磷酸酶(ALP)较野生型小鼠明显增加,并且Dhcr24转基因雌鼠的体重比野生型小鼠明显降低,均有显著差异。但Dhcr24转基因雄鼠各项指标与野生型小鼠相比没有显著差异。结论成功建立了全身表达Dhcr24转基因小鼠,并证实Dhcr24基因对雌性小鼠的体重和血生化指标,包括LDH,TP,Alb,SCr,HDL-c and ALP具有明显的影响。
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