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第十三届中国实验动物科学年会

作者：党女孟爱民中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室

Ⅱ型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）是目前全球最常见的代谢综合征,流行病学资料显示全球约有8%的成年人患有T2DM。二型糖尿病人与同龄人相比,预期寿命平均缩短6年。有观点认为糖尿病人可能经历了一个提前衰老的过程。衰老是... 详细信息

Ⅱ型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）是目前全球最常见的代谢综合征,流行病学资料显示全球约有8%的成年人患有T2DM。二型糖尿病人与同龄人相比,预期寿命平均缩短6年。有观点认为糖尿病人可能经历了一个提前衰老的过程。衰老是器官或组织逐渐丧失功能的过程,而细胞衰老（cell senescence）是衰老的细胞学基础。细胞衰老是指细胞应激致细胞产生不可逆的永久性细胞周期停滞的状态,这些内外刺激包括端粒侵蚀、DNA损伤、氧化应激以及癌基因活化等等。研究发现,细胞衰老与糖尿病的关系是相当复杂而微妙,糖尿病造成的高糖、炎症微环境及脂毒性等促使细胞衰老并进一步累积,反之,细胞衰老由于永久性周期停滞直接引起胰岛β细胞功能障碍、脂质代谢障碍等细胞功能障碍、通过间接分泌衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）介导慢性低水平炎症状态等,引起糖尿病及其并发症。Aguayo等人证明表达p16等衰老标志的β细胞,其胰岛素分泌功能有障碍,能导致类糖尿病样改变。此外,利用胰岛素受体拮抗剂S961饲喂C57BL/6J小鼠构建胰岛素抵抗模型,以及使用慢性内质网应激Ins2（Akita）小鼠模型,发现该两种模型在发生胰岛素抵抗等类糖尿病样病变的同时,p16、Igf1r、Bambi等β细胞衰老标志物的mRNA表达明显上调,证明胰岛素抵抗也可以导致β细胞衰老。也就是说,细胞衰老可能是糖尿病发生发展的关键环节,既是糖尿病代谢改变和组织损伤的后果,又是造成糖尿病及其并发症的原因之一。因此,针对细胞衰老与糖尿病之间联系环节的治疗,有可能为糖尿病提供新的治疗策略。

关键词：细胞衰老 Ⅱ型糖尿病衰老相关分泌表型SASP 动物模型

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建立博来霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7衰老细胞模型

建立博来霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7衰老细胞模型

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第十三届中国实验动物科学年会

作者：管博文杨银孟爱民中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的细胞衰老在老年性疾病发生发展过程中起重要作用,也成为治疗衰老相关疾病的重要靶点。本项实验通过博来霉素(BLM)诱导巨噬细胞衰老,建立细胞衰老模型并应用该模型观察衰老清除剂ABT263对衰老细胞的杀伤作用。方法首先用建立BLM诱导R... 详细信息

目的细胞衰老在老年性疾病发生发展过程中起重要作用,也成为治疗衰老相关疾病的重要靶点。本项实验通过博来霉素(BLM)诱导巨噬细胞衰老,建立细胞衰老模型并应用该模型观察衰老清除剂ABT263对衰老细胞的杀伤作用。方法首先用建立BLM诱导RAW264.7细胞衰老模型。在24孔板中,每孔接种2×10～4细胞,置于37℃培养箱培养24h,分别向每孔加入BLM调至0,12.50,25.00,50.00,100.00,200.00μg/mL,继续培养72h,用β-gal试剂盒进行染色,显微镜下观察统计衰老百分比。之后测定ABT263对RAW264.7增殖能力的影响,将细胞分为veh组和ABT263组,接种在96孔板,每孔接种4000个,置于37℃培养箱培养48h。veh组吸除上清加入0.2%DMSO的DMEM,继续培养24h。ABT263组吸除上清分别加入ABT263浓度为0,3.125,6.25,12.5,25,50μM的DMEM。继续置于37℃培养箱中培养24h。随后采用MTT法测细胞生存率。最后测定ABT263对衰老RAW264.7细胞的细胞毒作用。将细胞分为BLM+veh组和BLM+ABT263组。接种在24孔板上,每孔接种4×104个细胞,置于37℃培养箱培养24h。之后每孔加入BLM,调成50μg/mL培养72h。之后吸除上清,BLM+veh组加入0.2%DMSO的DMEM,培养24h。BLM+ABT263组分别加入ABT263浓度为3.1256.25,12.5,25,50μM的DMEM溶液,培养24h。随后采用MTT法测细胞生存率。结果 BLM诱导RAW264.7细胞出现衰老,分别为0.24%,18.79%,28.83%,46.01%,56.78%,57.21%,呈剂量依赖。测定ABT263对RAW264.7增殖能力影响的试验中将veh组的生存率设为100%,ABT263不同浓度组的生存率分别为109.22%、91.92%、88.64%、88.69%和10.74%。IC50=32.31μM。在测定ABT263对衰老RAW264.7细胞的细胞毒作用试验中将BLM+veh组的生存率设为100%,BLM+ABT263组的生存率按浓度由低到高分别为66.03%、54.42%、46.06%、32.78%和21.88%。IC50=8.580μM。结论 (1)BLM可以诱导RAW264.7细胞衰老,其中50μg/mL的BLM可最有效诱导出衰老,构建衰老细胞模型。可用于筛选清除衰老细胞的药物。(2)在给予低剂量Bcl-2抑制剂ABT263时,RAW264.7的生存率没有明显下降。当50μM的浓度时,细胞生存率明显降低,与veh组相比具有显著性差异。提示该模型能筛选清除衰老的药物。

关键词： ABT263 RAW264.7细胞衰老博来霉素

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中药Ⅰ号方对阿尔兹海默病作用的抗体芯片分析

中药Ⅰ号方对阿尔兹海默病作用的抗体芯片分析

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中国微循环学会神经变性病专业委员会第五届学术年会暨第二届北京国际神经变性病学术大会、北京神经变性病学会第一届学术会议

作者：史长华陈巍张玲秦川北京协和医学院比较医学中心中国医学科学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021

目的利用抗体芯片技术研究中药Ⅰ号方(PN-1)对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠蛋白分子的差异表达,初步探讨其作用机制.方法将APP swe/PS1 ΔE9(PAP)的AD模型小鼠分为AD模型组(PAP),PN-1治疗组,相同月龄的正常野生型C57BL/6J小鼠作为空白对... 详细信息

目的利用抗体芯片技术研究中药Ⅰ号方(PN-1)对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠蛋白分子的差异表达,初步探讨其作用机制.方法将APP swe/PS1 ΔE9(PAP)的AD模型小鼠分为AD模型组(PAP),PN-1治疗组,相同月龄的正常野生型C57BL/6J小鼠作为空白对照组(WT),PAP组和空白对照组每天给予双蒸水灌胃,给药组每天给予中药提取物灌胃,给药3个月后,利用Kinex TM Antibody Microarray 筛选差异表达蛋白,然后用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)进行分析,应用蛋白印迹法(Western blot)和免疫组化验证芯片结果.采用SPSS 20.0软件进行统计分析,采用独立样本t检验和校正t检验分析组间差异.结果与WT组相比,PAP组小鼠海马差异表达蛋白共66个,33个上调,33下调,其中caspase6和caspase9上调,PAXI,HSPB1下调;与PAP组相比,PN-1治疗组差异表达蛋白共65个,30个上调,35个下调,其中PAXI,caspase6和caspase9下降;VEGFR和AKT(ser)升高.IPA生物信息学分析得出PN-1可通过VEGF通路发挥作用;Western blot检测结果显示,与PAP组相比较,PN-1治疗组VEGFR和AKT磷酸化水平上调(P＜0.01),免疫组化结果显示,与PAP组相比较,PN-1治疗组caspase9下调(P＜0.01),CD105上调(P＜0.05)与芯片结果一致.结论 PN-1可通过VEGF信号通路直接或间接参与血管生成,并在神经元的修复过程中起重要作用.

关键词：阿尔茨海默病中药Ⅰ号方 Kinex TM Antibody Microarray

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长非编码RNA的功能及其在阿尔茨海默病中的作用

长非编码RNA的功能及其在阿尔茨海默病中的作用

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第十三届中国实验动物科学年会

作者：史长华张玲秦川北京协和医学院比较医学中心中国医学科学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNAs)是真核细胞中转录本长度大于200核苷酸的非编码RNA。lncRNAs作用机制众多,可在表观遗传、转录、转录后不同水平对靶基因表达进行调控,广泛参与生物体的各种生理及病理过程。lncRNAs的异常表... 详细信息

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNAs)是真核细胞中转录本长度大于200核苷酸的非编码RNA。lncRNAs作用机制众多,可在表观遗传、转录、转录后不同水平对靶基因表达进行调控,广泛参与生物体的各种生理及病理过程。lncRNAs的异常表达与肿瘤、心血管系统疾病、神经退行性疾病等的发生发展密切相关。在神经系统,lncRNAs表达丰富与其疾病状态表现出强相关性。近年来的研究表明,lncRNA参与阿尔茨海默病中β淀粉酶的的生成,突触损伤,神经营养因子的丢失,炎症,线粒体功能障碍,氧化应激等作用。本文就lncRNAs在阿尔茨海默病中的研究进展进行综述,以期为阿尔茨海默病的防治提供新的思路。

关键词：长链非编码RNA 阿尔茨海默病神经发育,突触可塑性

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食蟹猴脂肪间充质干细胞的分离与鉴定

食蟹猴脂肪间充质干细胞的分离与鉴定

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2017第十九届中国科协年会

作者：高舒平石桂英曲春辉黄澜徐艳峰韩云林秦川北京协和医学院中国医学科学院医学实验动物研究所干细胞与临床转化实验室卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021

脂肪间充质干细胞目前被认为是最有希望和应用前途的干细胞来源,它可以实现自体的干细胞移植,是干细胞移植的理想的种子细胞.目的：分离并鉴定食蟹猴脂肪间充质干细胞,为灵长类动物模型进行干细胞安全性,有效性评价探寻新的干细胞移植...

脂肪间充质干细胞目前被认为是最有希望和应用前途的干细胞来源,它可以实现自体的干细胞移植,是干细胞移植的理想的种子细胞.目的：分离并鉴定食蟹猴脂肪间充质干细胞,为灵长类动物模型进行干细胞安全性,有效性评价探寻新的干细胞移植治疗细胞来源.方法：无菌采取食蟹猴腹部皮下脂肪,机械剪碎为0.5mm2,采用0.075％含的胶原酶I消化,应用高糖-DMEM培养基(添加2ng/mlβ-FGF)培养,观察细胞形态特征,进行转录组测序分析,碱性磷酸酶染色,定量PCR,免疫组化,流式细胞技术分析细胞抗原标志的表达,并检测其体外成骨,软骨,成脂细胞分化,神经分化等的多向分化潜能.结果：运用组织块贴壁法可以从新鲜脂肪组织中分离到贴壁生长阳性表达的类似成纤维细胞样细胞,碱性磷酸酶染色结果阳性,进行转录组测序分析表明脂肪干细胞高表达干细胞的干性基因和细胞活性因子,PCR结果显示表达Nanog,Oct4,Tert,Bmi等干性基因,流式分析结果显示高表达CD29,CD73,CD90,CD105,不表达CD11b,CD44,HLA.这些细胞在体外诱导分化培养后可分别检测到脂滴,成骨细胞,软骨细胞和神经细胞.

关键词：

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利用dCas9-FokⅠ编辑大鼠Dnmt1基因

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中国生物化学与分子生物学报 2016年第7期32卷 841-848页

作者：张旭于磊陈炜高珊潘硕张连峰马元武中国医学科学院&北京协和医学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021

CRISPR/Cas9的发现为多种生物的基因编辑提供了强有力的工具。然而,该系统在提供靶向性基因修饰的同时,会产生一些不需要的突变,即脱靶现象。为提高CRISPR/Cas9的特异性,我们将野生型Fok I核酸内切酶的功能结构域与催化功能区失活的Cas... 详细信息

CRISPR/Cas9的发现为多种生物的基因编辑提供了强有力的工具。然而,该系统在提供靶向性基因修饰的同时,会产生一些不需要的突变,即脱靶现象。为提高CRISPR/Cas9的特异性,我们将野生型Fok I核酸内切酶的功能结构域与催化功能区失活的Cas9蛋白(dCas9)进行融合,形成融合蛋白用于降低脱靶效应。FokⅠ是一种依赖于二聚化才能行使内切酶活性的核酸酶,在本研究中,通过将FokⅠ功能结构融合到dCas9的N端,构建表达质粒p ST1374-dCas9-FokⅠ。我们前期研究中,发现一个sgRNA在介导Cas9编辑Dnmt1基因建立条件敲除大鼠时,存在显著的脱靶现象。以此为基础,我们利用dCas9-FokⅠ/sgRNA系统编辑大鼠Dnmt1基因,研究该系统是否能够进行基因编辑以及是否能够提高基因编辑特异性。将转录好的dCas9-FokⅠmRNA和sgRNA显微注射到SD大鼠的受精卵中,用于产生基因编辑大鼠。通过显微注射以及胚胎移植,最终获得43只F0代大鼠,其中两只在靶点位置包含突变,突变效率达4.5%。对脱靶情况进行分析,结果显示,无脱靶现象存在。综上,表明dCas9-FokⅠ/sgRNA可以应用于编辑大鼠基因,并能显著提高特异性。尽管dCas9-FokⅠ/sgRNA系统相比于Cas9/sgRNA系统,基因编辑效率有所下降,但是该技术的发展为基因治疗提供了可供选择的潜在工具。

关键词： Dnmt1 基因编辑大鼠 dCas9 FokⅠ 脱靶

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线粒体与衰老

线粒体与衰老

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第十三届中国实验动物科学年会

作者：王玉全李程程樊飞跃孟爱民中国医学科学院医学实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室

衰老是一个复杂的生物学过程,细胞衰老(cell aging)是指细胞在执行生命活动过程中,随着时间的推移,细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。研究发现越来越多的疾病与细胞衰老有关,例如肿瘤、特发性肺纤维化、高血压、帕... 详细信息

衰老是一个复杂的生物学过程,细胞衰老(cell aging)是指细胞在执行生命活动过程中,随着时间的推移,细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。研究发现越来越多的疾病与细胞衰老有关,例如肿瘤、特发性肺纤维化、高血压、帕金森综合征、糖尿病等。因此,衰老机制的研究对于相关疾病致病机制的认识,治疗方法的发现,治疗药物的研发具有重要而深远的意义。近年来对于细胞衰老的分子机制的研究进展迅速,主要包括氧化自由基学说,DNA损伤积累,和端粒缩短等。线粒体作为细胞的"能量工厂",在氧自由基(ROS)的产生和干细胞稳态调节上具有重要的作用,其质量、活性改变与细胞衰老密切相关。线粒体损伤引发的线粒体功能障碍能够导致ROS代谢紊乱,ROS水平的升高具有细胞毒性作用,造成脂质、蛋白质、DNA损伤,细胞周期阻滞,激活DNA损伤应答(DDR),导致细胞衰老。线粒体自噬,能够选择性清除衰老、损伤的线粒体,促进线粒体更新,维持线粒体功能。有研究提示提高衰老细胞中线粒体自噬水平可以清除损伤的线粒体,降低细胞内ROS,进而缓解细胞衰老表型。成体干细胞对人体自我修复和组织再生至关重要,越来越多的研究表明衰老与干细胞功能的下降密切相关。线粒体自噬可以有效清除干细胞中功能缺陷的线粒体,维持干细胞功能。前期研究显示肌肉干细胞中线粒体自噬能力下降,加速细胞衰老;老年动物造血干细胞线粒体自噬功能下降,导致线粒体堆积,代谢活性升高,造血干细胞自我更新和静态维持能力下降。综上,线粒体功能改变可能影响细胞衰老过程。线粒体损伤修复很可能是应对细胞衰老有效的靶向策略。具体的分子机制还需进一步论证。

关键词：衰老细胞衰老线粒体 ROS 干细胞线粒体自噬

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基于实时细胞分析技术检测前列腺癌细胞药物敏感性

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中国比较医学杂志 2016年第4期26卷 46-52页

作者：靳亚西孙彩显高虹张连峰张丽中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021

目的基于实时细胞分析技术发展,以更加简便稳定的方法进行药物敏感性评估,为前列腺癌临床治疗提供参考。方法选取VCa P、DU145、PC-3、PC-3M-2B4和PC-3M-IE8五株人前列腺癌细胞,选用多西他赛、卡巴他赛和醋酸阿比特龙三种前列腺癌治疗药... 详细信息

目的基于实时细胞分析技术发展,以更加简便稳定的方法进行药物敏感性评估,为前列腺癌临床治疗提供参考。方法选取VCa P、DU145、PC-3、PC-3M-2B4和PC-3M-IE8五株人前列腺癌细胞,选用多西他赛、卡巴他赛和醋酸阿比特龙三种前列腺癌治疗药物,分别梯度浓度给药,利用RTCA检测给药前后的细胞生长情况,确定药物对前列腺癌细胞的半抑制浓度(IC50)。结果多西他赛对VCa P、DU145、PC-3、PC-3M-2B4、PC-3M-IE8五种细胞系24 h的IC50分别为8.81 nmol/L、11.61 nmol/L、1.78 nmol/L、1.44 nmol/L、8.69 nmol/L。卡巴他赛24 h的IC50依次为3.73 nmol/L、3.96 nmol/L、10.41 nmol/L、5.43 nmol/L、7.37 nmol/L。醋酸阿比特龙24 h的IC50依次为8.34μmol/L、8.60μmol/L、24.20μmol/L、8.59μmol/L、13.21μmol/L。结论 PC-3M-2B4及DU145、VCa P及PC-3可作为多西他赛、卡巴他赛及醋酸阿比特龙的对照,建立体外筛选药物的细胞模型,为临床推广提供参考。

关键词：前列腺癌化疗药物实时细胞分析药物敏感性

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长期食用何首乌对小鼠造血系统的影响

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中国比较医学杂志 2016年第12期26卷 10-13页

作者：石桂英白琳中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021

目的探讨长期食用何首乌后,小鼠造血系统的变化。方法小鼠随机分为2组,对照组,喂饲正常饲料;何首乌饲料组,喂饲添加何首乌的饲料,10个月后,处死小鼠,应用流式细胞仪分析外周血、脾脏、胸腺及骨髓中各种细胞。结果何首乌饲料组小鼠,脾脏... 详细信息

目的探讨长期食用何首乌后,小鼠造血系统的变化。方法小鼠随机分为2组,对照组,喂饲正常饲料;何首乌饲料组,喂饲添加何首乌的饲料,10个月后,处死小鼠,应用流式细胞仪分析外周血、脾脏、胸腺及骨髓中各种细胞。结果何首乌饲料组小鼠,脾脏B细胞增多,胸腺CD4+细胞增多,CD8+细胞减少;骨髓造血干细胞显著减少,其中静止期细胞增多,增殖分裂期细胞减少。结论长期适量食用何首乌有助于减缓小鼠造血系统的衰老,维持造血系统稳定。

关键词：何首乌流式细胞术造血系统

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矢车菊素-3-葡萄糖苷对APP^(swe)/PS1^(ΔE9)阿尔茨海默病模型小鼠糖脂代谢的影响

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中国比较医学杂志 2016年第7期26卷 15-23页

作者：宋楠张玲陈巍张倩韩云林秦川北京协和医学院比较医学中心中国医学科学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021

目的探讨矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy3G)对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠糖脂代谢的影响。方法将7月龄APP^(swe)/PS1^(ΔE9)(PAP)的AD模型小鼠随机分为AD模型组(PAP)、Cy3G治疗组(PAPCy,5mg/kg/d)及同窝阴性对照组(n PAP);另外选择相同月龄的正... 详细信息

目的探讨矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy3G)对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠糖脂代谢的影响。方法将7月龄APP^(swe)/PS1^(ΔE9)(PAP)的AD模型小鼠随机分为AD模型组(PAP)、Cy3G治疗组(PAPCy,5mg/kg/d)及同窝阴性对照组(n PAP);另外选择相同月龄的正常野生型C57BL/6J小鼠分别作为空白对照组(WT)和Cy3G干预组(WTCy,5mg/kg/d);每组12只,雌雄各半。Cy3G灌胃8周后,用MicroPET/CT检测脑葡萄糖代谢率;血生化方法检测小鼠肝肾功能及脂代谢相关指标;取全脑称重并计算脏器系数,HE染色进行组织病理学检查;透射电镜观察海马中老年斑沉积情况;Western-blot分析Jun氨基末端激酶(JNK)和蛋白激酶B(AKT)的表达情况。结果MicroPET/CT结果显示,与WT组相比,PAP组小鼠脑^(18)F-FDG的摄取率显著降低(P<0.05),尤其在额叶和海马区降低尤为明显;与PAP组相比,PAPCy组小鼠额叶和海马区的^(18)F-FDG的摄取率显著升高(P<0.05)。血生化结果显示,与WT组相比,PAP组小鼠血清中天冬氨酸转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)水平显著升高(P<0.05),脂代谢指标相对正常;与PAP组相比,PAPCy组血清LDH水平显著降低(P<0.05)。脑组织HE染色未发现异常,但是在脑系数比较中,与WT组相比,PAP组小鼠脑系数显著降低(P<0.05);与PAP组相比,PAPCy组小鼠大脑的脑系数显著升高(P<0.05)。透射电镜下观察发现,WT组、WTCy组及nPAP组海马中未见有老年斑沉积,PAP组小鼠海马可观察到有老年斑沉积,而PAPCy组小鼠海马中老年斑沉积有所减少。Western blot结果显示,与WT组相比,PAP组JNK蛋白水平显著降低(P<0.05)、AKT蛋白水平显著升高(P<0.05);与PAP组相比,PAPCy组JNK蛋白水平显著升高(P<0.05),而AKT蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论 Cy3G可以有效改善AD模型小鼠脑葡萄糖代谢障碍,但对脂代谢调节并不显著,同时还能抑制大脑海马中老年斑的沉积。提示,Cy3G可能是通过JNK/AKT通路调节胰岛素抵抗和炎症反应。

关键词：阿尔茨海默病矢车菊素-3-葡萄糖苷葡脂代谢

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