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miR-34a、miR-155及miR-486基因多态性与宫颈癌前病变和宫颈癌相关性研究

中华肿瘤防治杂志 2022年第7期29卷 488-493页

作者：刘伟鹏许金美杨佳张芍俞晶梁燕严志凌李传印中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118 昆明医科大学第三附属医院妇科云南昆明650118

目的探讨微小RNA(microRNA/miR)-34a、miR-155和miR-486的单核苷酸多态性(SNP)与宫颈癌及宫颈上皮内瘤病变(CIN)的相关性。方法选取2018-05-7-2019-10-28昆明医科大学第三附属医院确诊的762例宫颈癌患者(宫颈癌组)和436例CIN患者(CIN组)... 详细信息

目的探讨微小RNA(microRNA/miR)-34a、miR-155和miR-486的单核苷酸多态性(SNP)与宫颈癌及宫颈上皮内瘤病变(CIN)的相关性。方法选取2018-05-7-2019-10-28昆明医科大学第三附属医院确诊的762例宫颈癌患者(宫颈癌组)和436例CIN患者(CIN组),并选取同一时期在该医院参加体检的1003名健康女性作为对照组。采用TaqMan探针基因分型的方法对3组人群中miR-34a基因SNP位点rs2666433、miR-155基因SNP位点rs1547354和miR-486基因SNP位点rs565491进行基因分型,并分析上述3个SNP位点与宫颈癌及CIN的关联性。结果miR-34a基因SNP位点rs2666433的等位基因(χ^(2)=7.932,P=0.005)和基因型(χ^(2)=13.022,P=0.002)在宫颈癌组和对照组之间分布频率差异有统计学意义,该结果表明该位点等位基因A(OR=1.24,95%CI:1.07~1.44)和基因型A/A(OR=1.98,95%CI:1.39~2.82)可能是宫颈癌发生的风险因素;而该位点的等位基因和基因型在CIN组和对照组之间分布频率差异无统计学意义,均P>0.016。miR-155基因SNP位点rs1547354和miR-486基因SNP位点rs565491的等位基因和基因型在宫颈癌组、CIN组和对照组之间的分布频率差异均无统计学意义,均P>0.016。结论miR-34a基因SNP位点rs2666433可能与宫颈癌的发生风险相关。

关键词：宫颈癌宫颈上皮内瘤病变单核苷酸多态性 microRNA 相关性

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多重耐药鲍曼不动杆菌外膜蛋白W的可溶性分析及复性、纯化条件优化

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生物技术 2025年

作者：裴龙滨龙琼马雁冰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所

[目的]构建重组载体,优化Omp W的表达、复性与纯化工艺,以提高复性蛋白的纯化制备效率。[方法]将外膜蛋白W(OmpW)的基因克隆于不同表达载体(pET-N-His-Pre Scission与p Thio His A),并转入大肠杆菌BL21(DE3)中,分别置于不同诱导温度(25... 详细信息

[目的]构建重组载体,优化Omp W的表达、复性与纯化工艺,以提高复性蛋白的纯化制备效率。[方法]将外膜蛋白W(OmpW)的基因克隆于不同表达载体(pET-N-His-Pre Scission与p Thio His A),并转入大肠杆菌BL21(DE3)中,分别置于不同诱导温度(25℃、30℃、37℃)和诱导时间(0 h、2 h、4 h、6 h、8 h)表达,收集菌液破碎离心以获得可溶性上清和包涵体沉淀,SDS-PAGE电泳分析重组蛋白可溶性;使用5种洗涤剂(Triton X-100、Triton X-114、尿素、吐温80、吐温20)分别或交叉洗涤包涵体沉淀,SDS-PAGE电泳分析洗涤效果;包涵体变性蛋白柱上复性或透析复性,利用Ni-NTA纯化Omp W目的蛋白,SDS-PAGE电泳并BCA法测量蛋白浓度。[结果]成功将Omp W基因克隆整合至p ET-N-His-Pre Scission、pThioHisA两个质粒,并构建了原核表达载体,重组蛋白在25℃、30℃、37℃诱导0 h、2 h、4 h、6 h、8 h均表达于包涵体沉淀中,在37℃诱导8 h达到了表达高峰;鉴定得到了包涵体沉淀的最佳洗涤剂组合:0.5%(吐温80、吐温20、TritonX-100)、3 mol/L尿素交叉洗涤1次;250 m L的菌液样品经柱上复性得到目的蛋白47 mg,纯度高达85%,透析复性后镍柱纯化仅得到6 mg,柱上复性蛋白的获取效率为透析复性的7.8倍。[结论]成功建立了优化的Omp W包涵体表达条件、洗涤方案及基于柱上复性的纯化技术,为基于Omp W的耐药性鲍曼不动杆菌外膜蛋白疫苗应用及生物学功能研究提供基础。

关键词：鲍曼不动杆菌外膜蛋白W(OmpW) 融合蛋白基因克隆原核表达包涵体洗涤纯化柱上复性

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疫苗生产过程的精细化管理

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中国医药导报 2024年第35期21卷 160-164页

作者：王明清杨璐洁牛杰陈林涛唐靖月赵冠华李娜岳俊陈洪波中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118

疫苗是人类对抗传染性疾病最有效的方法,而疫苗生产过程直接影响疫苗的安全性和有效性,同时影响疫苗的生产效率。精细化管理是一种注重细节,追求卓越的管理理念,在疫苗生产管理中具有重要意义。“人、机、料、法、环”是对全面质量管理... 详细信息

疫苗是人类对抗传染性疾病最有效的方法,而疫苗生产过程直接影响疫苗的安全性和有效性,同时影响疫苗的生产效率。精细化管理是一种注重细节,追求卓越的管理理念,在疫苗生产管理中具有重要意义。“人、机、料、法、环”是对全面质量管理理论中影响产品质量的5个因素简称,也是疫苗生产全面质量管理的关键。本文以精细化管理为依据,结合影响产品质量的5个主要因素分别对疫苗生产过程进行分析,提出相应解决措施,使疫苗生产管理规范化,促进疫苗生产企业高质量发展。

关键词：疫苗生产过程精细化管理全面质量管理

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SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体的制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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中国生物制品学杂志 2022年第3期35卷 327-333页

作者：李妮龙柏霖朱文勇钏鸿云宋绍辉刘婧吴雅楠廖国阳中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118 沈阳药科大学药学院辽宁沈阳110016

目的制备严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)棘突蛋白(spike protein,S)单克隆抗体(简称单抗),建立S蛋白抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证。方法通过杂交瘤... 详细信息

目的制备严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)棘突蛋白(spike protein,S)单克隆抗体(简称单抗),建立S蛋白抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证。方法通过杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体,并对单抗进行鉴定。用该单抗作为包被抗体,HRP标记的兔抗S蛋白多克隆抗体作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA方法,检测SARS-CoV-2 S蛋白抗原含量。对方法的包被抗体浓度(10、5、2.5、1.25μg/mL)、酶标抗体浓度(4、2、1μg/mL)以及封闭液种类(未封闭、PBS稀释的1%BSA、2%BSA、1%BSA+1%蔗糖、2%BSA+2%蔗糖)进行优化,并对方法的线性范围及灵敏度、特异性和准确性进行验证。用建立的方法对10份疫苗生产工艺不同阶段已知S蛋白抗原含量的样本进行检测,计算该方法与中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所新冠疫苗定量方法检测结果的符合率。结果筛选出18株S蛋白特异性单克隆抗体,7B10A2细胞株制备的腹水抗体纯化后浓度为4.487 mg/mL,纯度大于90%,可特异性结合新冠病毒S蛋白上S1亚基;抗体亚型为IgG2b型,抗体效价为1︰128 000,效应浓度为0.137μg/mL。建立的双抗体夹心ELISA方法最适包被抗体和酶标抗体浓度分别为5和4μg/m L,最适封闭液为2%BSA+2%蔗糖;在2.5~160 U范围内,相关系数(R2)大于0.99,检测灵敏度为1.25 U;该方法特异性良好,与核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)、BSA、PBS及流感病毒等不发生反应;准确性验证的回收率在92.10%~111.58%之间。用建立的方法检测已知含量样本符合率在94.2%~109%之间。结论制备了SARS-CoV-2 S蛋白特异性单抗,并建立了适用于SARS-CoV-2 S蛋白抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法,可用于疫苗产品及其工艺阶段样品和其他样本中S蛋白含量的检测。

关键词：严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型单克隆抗体双抗体夹心ELISA

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BTB与CNC同源蛋白1通过调节MYC相关因子X二聚化蛋白1基因对套细胞淋巴瘤发生发展的影响

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癌症进展 2024年第6期22卷 610-618页

作者：张紫婷张寒北京协和医学院/中国医学科学院/医学生物学研究所昆明6501180

目的探讨BTB与CNC同源蛋白1(BACH1)通过调节MYC相关因子X二聚化蛋白1(MXD1)基因对套细胞淋巴瘤(MCL)发生发展的影响。方法采用靶向剪切及转座酶技术(CUT&Tag)检测BACH1下游靶基因,并通过序列比对分析寻找BACH1与MXD1的结合位点。... 详细信息

目的探讨BTB与CNC同源蛋白1(BACH1)通过调节MYC相关因子X二聚化蛋白1(MXD1)基因对套细胞淋巴瘤(MCL)发生发展的影响。方法采用靶向剪切及转座酶技术(CUT&Tag)检测BACH1下游靶基因,并通过序列比对分析寻找BACH1与MXD1的结合位点。通过双荧光素酶报告基因系统验证BACH1对MXD1的调控作用,并采用慢病毒技术构建BACH1过表达及敲低的稳转MCL细胞株,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测MXD1蛋白表达水平。应用GSE16411数据集分析MCL细胞和正常B细胞中MXD1 m RNA相对表达量。应用GSE132929及GSE21452数据集筛选MXD1共表达基因,对MXD1共表达基因进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析。采用噻唑蓝(MTT)法检测MXD1正相关基因应激诱导磷蛋白1同源物含U-框蛋白1(STUB1)的特异性激活剂YL109处理后MCL细胞的活力。结果 BACH1能够靶向结合MXD1并抑制MXD1基因的启动子活性。BACH1敲低后MXD1蛋白表达水平升高,而BACH1过表达后MXD1蛋白表达水平降低。通过GSE16411数据集分析发现,MCL细胞中MXD1 mRNA相对表达量明显低于正常B细胞,差异有统计学意义(P﹤0.01)。在GSE132929数据集中筛选出2222个MXD1共表达基因,在GSE21452数据集中筛选出503个MXD1共表达基因。GO分析显示,MXD1共表达基因主要富集于信号转导、蛋白质磷酸化、细胞葡萄糖醛酸化、类黄酮葡萄糖醛酸化等代谢相关的生物学过程;KEGG信号通路分析显示,MXD1共表达基因主要富集于肝脏发育的代谢途径、蛋白质的消化和吸收、Janus激酶(JAK)/信号转导及转录激活因子(STAT)信号通路等。采用YL109处理MCL细胞后可显著降低细胞存活率。结论 BACH1通过结合MXD1近端启动子负向调控MXD1的表达水平,且BACH1介导的MXD1表达改变很可能通过调控代谢过程参与MCL的发生发展。

关键词：套细胞淋巴瘤 BTB与CNC同源蛋白1 MYC相关因子X二聚化蛋白1

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柯萨奇病毒A组6型和B组1型混合感染叙利亚金黄地鼠动物模型的实验研究

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中国比较医学杂志 2025年第1期35卷 30-40页

作者：侯婧涵段素琴徐鸿界孙文亭李明学李艳艳靳玮华陈丽雄刘权赵远杨凤梅和占龙中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 呼吸与共病全国重点实验室北京100005

目的建立柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)和B组1型(coxsackievirus B1,CVB1)混合感染叙利亚金黄地鼠手足口病动物模型。方法本研究将24只地鼠分为CVA6感染组、CVB1感染组、CVA6和CVB1混合感染组及对照组,采取鼻腔滴注病毒液和... 详细信息

目的建立柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)和B组1型(coxsackievirus B1,CVB1)混合感染叙利亚金黄地鼠手足口病动物模型。方法本研究将24只地鼠分为CVA6感染组、CVB1感染组、CVA6和CVB1混合感染组及对照组,采取鼻腔滴注病毒液和PBS方式造模。监测记录15 d内临床指标、生理指标、排毒情况,并在感染后第7天(D7)选取动物进行组织病理学和病毒抗原与核酸检测。结果单独和混合感染的实验组地鼠均出现类似人类手足口病的临床症状;WBC、NEUT、LYMPH结果提示病毒感染血象特征;咽拭子、粪便、血液和组织中均能检测到两种病毒核酸;粪便样品中能分离出两种病毒;脑等组织出现病理损伤表现及CVA6和CVB1病毒抗原蛋白和核酸的阳性共定位。结论经鼻腔同时滴注CVA6和CVB1混合液能够成功感染叙利亚金黄地鼠,复制出类似人类手足口病的疱疹、造成病毒性心肌炎和脑炎病理损伤等,结果显示混合感染组相较于单独感染组病情更为严重,表现为临床症状加重、病毒复制增高以及组织病理损伤明显。本研究为开展人类肠道病毒混合感染基础和临床研究提供一定借鉴和参考。

关键词：叙利亚金黄地鼠混合感染动物模型柯萨奇病毒A组6型柯萨奇病毒B组1型手足口病

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病理学检测在实验动物学相关领域中的作用

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生物医学 2024年第3期14卷 420-425页

作者：高家红龙海亭董荫良匡德宣中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明

实验动物是支撑科技进步与创新不可或缺的战略性资源,是国家保持科技领先、提高国际科技竞争力的核心要素之一。病理学检测是实验动物人畜共患病诊治、质量控制、疾病动物模型评价等领域不可或缺的手段和重要环节,通过对动物外观检查、... 详细信息

实验动物是支撑科技进步与创新不可或缺的战略性资源,是国家保持科技领先、提高国际科技竞争力的核心要素之一。病理学检测是实验动物人畜共患病诊治、质量控制、疾病动物模型评价等领域不可或缺的手段和重要环节,通过对动物外观检查、大体解剖、临床病理学和组织病理学的检查,能够对实验动物的健康状况有一个系统而全面的认识,也为动物质量保障和生物医学动物实验评价提供重要的依据。

关键词：病理学检测实验动物人畜共患病诊治质量控制疾病动物模型评价

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病原体感染角膜炎机制及动物模型研究进展

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中国比较医学杂志 2022年第4期32卷 137-144页

作者：陈柳邱敏代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 昆明医科大学昆明650500

感染性角膜炎是世界范围内的眼科常见疾病,是导致视力丧失和失明的重要原因。对微生物性角膜炎发病机制的全面认识、建立相关疾病的动物模型在研究宿主感染的免疫应答和感染机制、药物研发等方面扮演着重要作用,为临床治疗策略选择及基... 详细信息

感染性角膜炎是世界范围内的眼科常见疾病,是导致视力丧失和失明的重要原因。对微生物性角膜炎发病机制的全面认识、建立相关疾病的动物模型在研究宿主感染的免疫应答和感染机制、药物研发等方面扮演着重要作用,为临床治疗策略选择及基础研究提供了科学依据。随着医学研究的深入,我们对感染性角膜炎动物模型及致病机制进行归纳总结,期望对此有一个全面了解。

关键词：感染性角膜炎发病机制动物模型

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表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白受体结合域和N蛋白的重组腺病毒的构建及鉴定

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中国生物制品学杂志 2023年第9期36卷 1025-1031页

作者：宋泽鑫周艳林晓晨赵永美施鹏王学付张朝武李鸿钧中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所、云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的构建表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)Delta突变株S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)和N蛋白的重组腺病毒,并进行鉴定。方法将SARSCoV-2 RBD和N基因片段分别克隆至pcDNA3.0BA载体上,构建重组质粒pcDNA3.0BA-RBD-N,PCR扩增RBD-CMVN片段,连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,将穿梭质粒pShuttle-RBD-N与pAdeasy-1进行同源重组,获得重组质粒pAdeasy-1-RBD-N,转染HEK293细胞进行重组腺病毒Ad-RBD-N包装,RT-PCR法检测重组腺病毒中RBD和N基因在HEK293细胞中的转录,Western blot和免疫荧光法检测重组腺病毒中RBD和N蛋白的表达。将Ad-RBD-N通过肌肉注射免疫12只雌性BALB/c小鼠,免疫剂量为5×10^(9)copies/只,免疫后14 d经尾静脉采血,ELISA法检测血清抗体效价。结果重组腺病毒RBD和N基因能在HEK293细胞中正常转录,RBD和N蛋白能在MA104细胞中正常表达。免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对RBD和N蛋白的特异性IgG抗体。结论成功构建了表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白RBD和N蛋白的重组腺病毒,为Delta突变株疫苗的后续研究奠定了基础。

关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒2 S蛋白受体结合域 N蛋白腺病毒

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病毒通过Rubicon抑制自噬晚期或干扰素的产生实现固有免疫逃逸的研究进展

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细胞与分子免疫学杂志 2025年第1期41卷 83-89页

作者：宿俊玮袁瑾王峰李珺岳磊严敏昆明医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系云南昆明650500 浙江大学邵逸夫医院麻醉科浙江杭州310016 云南省普洱市中医医院检验科云南普洱665099 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118

固有免疫反应是宿主抵御病毒感染的第一道防线。通过自噬靶向降解病原微生物,协同模式识别受体诱导干扰素(IFN)产生,是机体抵御病毒感染的重要途径。Rubicon,一种Run结构域Beclin 1相互作用和富含半胱氨酸结构域蛋白,对自噬和IFN产生具... 详细信息

固有免疫反应是宿主抵御病毒感染的第一道防线。通过自噬靶向降解病原微生物,协同模式识别受体诱导干扰素(IFN)产生,是机体抵御病毒感染的重要途径。Rubicon,一种Run结构域Beclin 1相互作用和富含半胱氨酸结构域蛋白,对自噬和IFN产生具有抑制效应。一方面,Rubicon作为磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)复合体的一种结合成分,通过不同的结构域分别与液泡蛋白分选34(Vps34)、紫外线辐射耐受相关基因(UVRAG)、小鸟苷三磷酸(GTP)激酶和RAS癌基因家族成员7(Rab7)相互作用,介导自噬成熟抑制;另一方面,Rubicon抑制核因子κB关键调节因子(NEMO)的泛素化和干扰素调节因子3(IRF3)的二聚化,进而阻断IFN产生相关的信号转导。研究发现卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、仙台病毒(SeV)、丙型肝炎病毒(HCV)等多种病毒,通过调节Rubicon的表达或功能实现固有免疫逃逸,Rubicon有望成为抗病毒治疗的新靶点。

关键词：病毒 Rubicon 干扰素(IFN) 自噬固有免疫逃逸综述

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