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医学研究杂志 2015年第3期44卷 56-60页

作者：张军红杨晶王春华袁芳李青李静赵春华河北省邢台市眼科医院/河北省眼病治疗中心/河北省眼科研究所 054000 河北医科大学生理学教研室 050017 贵阳医学院附属医院骨科 550004 组织工程中心中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院细胞生物学系100005

目的探讨乳腺癌易感基因2(breast cancer suscepbility gene 2,BRCA2)对上皮型乳腺癌癌症干细胞的影响及从Notch信号角度分析其机制。方法利用本实验室前期建立的反转录病毒干扰载体p MSCVneo/e GFP-U6构建BRCA2的载体,合成慢病毒颗粒,... 详细信息

目的探讨乳腺癌易感基因2(breast cancer suscepbility gene 2,BRCA2)对上皮型乳腺癌癌症干细胞的影响及从Notch信号角度分析其机制。方法利用本实验室前期建立的反转录病毒干扰载体p MSCVneo/e GFP-U6构建BRCA2的载体,合成慢病毒颗粒,转染上皮型乳腺癌细胞系MCF7细胞。筛选出单克隆细胞后,利用Western blot法检测MCF7细胞中干扰BRCA2的效果。球形成试验分析干扰BRCA2后对MCF7上皮型乳腺癌干细胞的影响。克隆形成试验分析BRCA2下调后对MCF7上皮型乳腺癌干细胞增殖能力的影响。Western blot法检测乳腺癌癌症干细胞自我更新因子Notch1和Notch4在干扰BRCA2的上皮型乳腺癌中的影响。结果干扰BRCA2的反转录病毒载体和对照载体测序正确,可以合成反转录病毒。Western blot法发现干扰BRCA2的上皮型乳腺癌细胞系MCF7细胞中BRCA2的表达较对照细胞显著下调。球形成试验结果显示干扰BRCA2的上皮型乳腺癌细胞系MCF7细胞球形成数量较对照细胞显著增加。克隆形成试验结果显示干扰BRCA2的上皮型乳腺癌细胞系MCF7细胞克隆形成能力较对照细胞显著增加。Western blot法检测结果显示干扰BRCA2的上皮型乳腺癌细胞系MCF7细胞中Notch1的表达较对照细胞显著上调,未在对照和干扰BRCA2的MCF7细胞中检测到Notch4的表达。结论BRCA2沉默的上皮型乳腺癌细胞系MCF7细胞可通过上调Notch1表达使其形成癌症干细胞的能力增加。

关键词： BRCA2 乳腺癌癌症干细胞 Notch1

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干细胞分化的表观遗传调控

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遵义医科大学学报 2014年第5期37卷 463-469页

作者：赵春华毛晓晶韩钦中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院组织工程中心

干细胞具有自我更新能力和多谱系细胞分化能力,在基础医学和临床应用中有极大研究意义。以胚胎干细胞为模型,近年来干细胞分化的表观遗传调控已成为研究热点。染色质结构的表观遗传调控,比如DNA甲基化、翻译后组蛋白修饰,对于胚胎发育... 详细信息

干细胞具有自我更新能力和多谱系细胞分化能力,在基础医学和临床应用中有极大研究意义。以胚胎干细胞为模型,近年来干细胞分化的表观遗传调控已成为研究热点。染色质结构的表观遗传调控,比如DNA甲基化、翻译后组蛋白修饰,对于胚胎发育时基因的激活和抑制非常关键。本文综述了干细胞多潜能性维持和干细胞分化的表观遗传机制及其一些表观遗传修饰之间的联系。

关键词：干细胞细胞分化表观遗传

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人羊膜间充质干细胞对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的疗效及免疫调节作用

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免疫学杂志 2014年第1期30卷 6-12页

作者：方宁李丹余丽梅章涛赵春华陈代雄遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室 563003 中国医学科学院基础医学研究所组织工程中心北京100005

目的探讨人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的治疗效应和免疫调节作用。方法分离、培养hAMSCs,流式细胞术(FCM)检测其免疫表型;用豚鼠脊髓匀浆+完全弗氏佐剂+百日咳毒素复制大鼠EAE模型;模型动物随机... 详细信息

目的探讨人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的治疗效应和免疫调节作用。方法分离、培养hAMSCs,流式细胞术(FCM)检测其免疫表型;用豚鼠脊髓匀浆+完全弗氏佐剂+百日咳毒素复制大鼠EAE模型;模型动物随机分为正常对照组、模型组、培养基组、hAMSCs治疗组和泼尼松治疗组,每组6只。hAMSCs治疗组经双侧侧脑室移植5×105个hAMSCs;采用Kono评分法动态观察行为学变化;采用HE染色、免疫荧光染色观察脑和脊髓病理改变以及hAMSCs在脑和脊髓内的分布;采用FCM检测外周血淋巴细胞亚群,采用流式微球阵列法(CBA)检测血浆细胞因子的含量。结果 hAMSCs治疗后EAE大鼠行为学评分逐渐减低(P<0.01),脑和脊髓炎性细胞浸润减轻。hAMSCs移植第3周,大鼠脑和脊髓组织可见较多人细胞核抗原阳性细胞即hAMSCs存活;与模型组和培养基组相比,hAMSCs治疗组外周血Treg、Th2、Tc1、Tc2淋巴细胞百分比明显升高(P<0.01或P<0.05),而Th17细胞显著减少(P<0.01);血浆Th2型细胞因子IL-4和IL-10含量升高(P<0.05或P<0.01),而Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ含量降低(P<0.05或P<0.01)。结论 hAMSCs能改善大鼠EAE的神经功能,减轻神经组织的免疫损伤,其机制可能主要与上调FoxP3+Treg细胞和下调Th17细胞有关。

关键词：人羊膜间充质干细胞实验性自身免疫性脑脊髓炎免疫调节大鼠

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骨髓间充质干细胞抑制CD4^+初始T细胞体外分化为Th17细胞

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基础医学与临床 2014年第9期34卷 1179-1183页

作者：曲学彬刘星霞韩晶晶姚瑞芹赵春华徐州医学院基础学院生物学系江苏徐州221009 中国医学科学院基础医学研究所组织工程中心北京100005 徐州医学院临床学院神经内科江苏徐州221002

目的探讨骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)对辅助T细胞17(Th17)体外分化的免疫调控作用。方法小鼠CD4+初始T(nave T)细胞与小鼠BM-MSCs共培养,诱导分化3 d后流式细胞术检测CD4+IL-17+Th17的生成比率,ELISA法检测培养上清中IL-17的浓度,qRT-... 详细信息

目的探讨骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)对辅助T细胞17(Th17)体外分化的免疫调控作用。方法小鼠CD4+初始T(nave T)细胞与小鼠BM-MSCs共培养,诱导分化3 d后流式细胞术检测CD4+IL-17+Th17的生成比率,ELISA法检测培养上清中IL-17的浓度,qRT-PCR及Western blot检测Th17特异转录因子Rorγt的表达水平。共培养体系中加入IL-10和PGE2中和抗体后检测Th17的分化率。结果小鼠BM-MSCs分泌高水平细胞因子TGF-β和IL-6。共培养组CD4+IL-17+Th17的生成率(2.5%±1.5%)和IL-17浓度(23±3 ng/L)均显著低于无BM-MSCs对照组(分别为17.8%±4.2%和268±27 ng/L,P<0.05),且转录因子Rorγt的表达量也明显降低。共培养组IL-10和PGE2浓度随诱导天数的增加而逐渐上升,显著高于同期对照组(P<0.05)。共培养体系中加入IL-10或PGE2中和抗体后,显著提升CD4+IL-17+Th17的生成率(从2.0%±0.5%提高到11.8%±2.5%,P<0.05),提高IL-17分泌水平(从24±4 ng/L上升到123±25 ng/L,P<0.05),增强Rorγt的表达量。联合使用两种中和抗体能进一步提高Th17的分化生成率。结论虽然BM-MSCs分泌高水平的Th17分化所需的细胞因子TGF-β和IL-6,但BM-MSCs却抑制Th17的体外分化,其抑制机制可能与IL-10和PGE2有关。

关键词：骨髓间充质干细胞初始T细胞辅助T细胞17

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间充质干细胞系统：解析机体免疫调控和代谢平衡

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中国实验血液学杂志 2013年第2期21卷 263-267页

作者：赵春华北京协和医学院、中国医学科学院基础医学研究所组织工程中心协和医院北京100000

间充质干细胞由于其独特的生物学特性和临床应用潜能,一直是干细胞研究的热点。这里,我首次提出间充质干细胞系统新概念:自胚胎发育早期,经历整个生长发育全过程的不同胚层、多个发育阶段,将亚全能间充质干细胞到不同等级分化潜能间充质... 详细信息

间充质干细胞由于其独特的生物学特性和临床应用潜能,一直是干细胞研究的热点。这里,我首次提出间充质干细胞系统新概念:自胚胎发育早期,经历整个生长发育全过程的不同胚层、多个发育阶段,将亚全能间充质干细胞到不同等级分化潜能间充质干/祖细胞群体统称为MSC系统。MSC系统的确立具有重要意义:(1)赋予了MSC三大重要生物学特征,即干细胞自身特性、组织微环境功能及免疫调控功能;(2)平衡机体免疫与组织代谢;(3)提供高效转化为临床安全有效的组织特异性干细胞。总之,该系统很好的解释了间充质干细胞的异质性,同时丰富了我们之前提出的亚全能干细胞理论,为研究人员更好的理解间充质干细胞提供了深厚的理论平台。

关键词：干细胞间充质干细胞间充质干细胞系统

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乳腺干细胞培养基的建立及有效性验证

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中国组织工程研究 2014年第10期18卷 1585-1590页

作者：张军红杨晶豆晓伟王春华李青赵春华中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院组织工程中心细胞生物学系北京市100051 河北省邢台市眼科医院河北省眼病治疗中心河北省眼科研究所病理科河北省邢台市054000 河北医科大学生理学教研室河北省石家庄市050017 河北省邢台市眼科医院河北省眼病治疗中心河北省眼科研究所耳鼻喉科河北省邢台市054000 贵阳医学院附属医院骨科贵州省贵阳市550004

背景:干细胞培养基,尤其是乳腺干细胞培养基现阶段尚无有效的制备方法。目的:利用Sca-1+乳腺细胞验证自制乳腺干细胞培养基的有效性。方法:用BM培养基培养乳腺器官样小体,6 d后以免疫荧光方法监测成纤维细胞Sca-1和vimentin的表达。筛选... 详细信息

背景:干细胞培养基,尤其是乳腺干细胞培养基现阶段尚无有效的制备方法。目的:利用Sca-1+乳腺细胞验证自制乳腺干细胞培养基的有效性。方法:用BM培养基培养乳腺器官样小体,6 d后以免疫荧光方法监测成纤维细胞Sca-1和vimentin的表达。筛选出MaECM培养基,培养乳腺细胞6 d后,免疫磁珠筛选Sca-1+和Sca-1-细胞群,流式细胞术分析Sca-1阳性细胞的纯度,1×104 Sca-1+或Sca-1-细胞种植在4只鼠双侧乳腺脂肪垫上,6-8周后取出乳腺脂肪垫,以卡红整体染色和苏木精-伊红染色分析长出乳腺的结构数量。结果与结论:乳腺器官样小体用BM培养基培养6 d后,检测到大量Sca-1和vimentin阳性的成纤维细胞,说明BM培养基不适合分离Sca-1+乳腺干细胞。筛选出的MaECM培养基能够抑制成纤维的生长。磁珠筛选后,流式细胞术检测Sca-1+细胞在Sca-1+和Sca-1-细胞群的纯度分别是92%和5%。移植实验显示在8个种植Sca-1+细胞的脂肪垫生长出6个乳腺结构;而在8个种植Sca-1-细胞的脂肪垫中除1只鼠死亡,其余脂肪垫中均未长出乳腺结构。提示MaECM培养基适用于培养鼠乳腺干细胞。

关键词：干细胞培养乳腺干细胞成纤维细胞 Sca-1 乳腺干细胞培养基国家重大科学研究计划(973)资助项目 863项目

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骨髓间充质干细胞移植治疗难治型原发性胆汁性肝硬化初探

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中华风湿病学杂志 2013年第9期17卷 580-584页

作者：王立韩钦陈华孔芳杨云娇赵岩李永哲张烜崔全才卢朝辉张奉春赵春华中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院风湿免疫科 100032 中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科 100032 中国医学科学院北京协和医学院基础所组织工程中心

目的评价骨髓间充质干细胞（BM-MSC）移植治疗难治型原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者的有效性和安全性。方法入组10例对熊去氧胆酸（UDCA）生化应答不良的难治型PBC患者，自愿提供健康一级亲属作为供者，在之前治疗基础上，进行BM。MSC... 详细信息

目的评价骨髓间充质干细胞（BM-MSC）移植治疗难治型原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者的有效性和安全性。方法入组10例对熊去氧胆酸（UDCA）生化应答不良的难治型PBC患者，自愿提供健康一级亲属作为供者，在之前治疗基础上，进行BM。MSC移植治疗1次。观察治疗时不良反应及治疗后第1、3、6、12个月的临床表现、生化指标、肝脏病理等方面变化。计量资料的比较采用配对t检验。结果①异基因BM-MSC移植安全性好，未出现移植相关不良事件；②难治型PBC患者在BM—MSC移植后，在“瘙痒”、“社会功能”及“情绪”等生活质量方面有所改善；③异基因BM—MSC移植治疗可降低PBC患者的丙氨酸转氨酶[（106＋31）U／L与（72±18）U／L，t=2．785，P=0．021]和天冬氨酸转氨酶[（81＋15）U／L与（64±12）U／L，t=2．343，P=0．047]，差异有统计学意义；④经***移植治疗，PBC患者肝脏病理无明显变化；⑤该治疗方法在6～12个月时疗效最佳。结论异基因***移植的安全性好，可改善难治型PBC患者生活质量，降低转氨酶等生化指标，但可能并不改善肝脏病理。

关键词：肝硬化胆汁性骨髓间质干细胞移植

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人羊膜上皮细胞治疗大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的效应及免疫调节作用

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中国免疫学杂志 2013年第10期29卷 1011-1016,1032页

作者：李丹方宁陈代雄余丽梅章涛赵春华遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室遵义563003 中国医学科学院基础医学研究所组织工程中心北京100005

目的:观察人羊膜上皮细胞(hAECs)对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的治疗效应和免疫调节作用。方法:分离、培养hAECs,流式细胞术(FCM)检测其免疫表型;用豚鼠脊髓匀浆+完全弗氏佐剂+百日咳毒素复制大鼠EAE模型;EAE大鼠经双侧侧... 详细信息

目的:观察人羊膜上皮细胞(hAECs)对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的治疗效应和免疫调节作用。方法:分离、培养hAECs,流式细胞术(FCM)检测其免疫表型;用豚鼠脊髓匀浆+完全弗氏佐剂+百日咳毒素复制大鼠EAE模型;EAE大鼠经双侧侧脑室移植5×105个hAECs;采用kono评分动态观察行为学变化;采用HE染色、免疫荧光染色观察脑和脊髓病理改变,以及hAECs在脑和脊髓内的分布;采用FCM检测外周血淋巴细胞亚群,采用流式微球芯片捕获技术(CBA)检测血浆细胞因子的含量。结果:hAECs治疗后EAE大鼠行为学评分逐渐减低(P<0.01),神经功能明显改善,体重稳定,脑和脊髓炎性细胞浸润减轻。hAECs移植后3周,宿主脑和脊髓组织中均有较多人细胞核抗原阳性细胞即hAECs存活;与对照组相比,hAECs治疗组FoxP3+Treg、Th2、CTL、NKT、B淋巴细胞百分比明显升高(P<0.01或P<0.05),而Th17细胞显著减少(P<0.01);Th2型细胞因子IL-4和IL-10含量升高(P<0.05或P<0.01),而Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ含量降低(P<0.05或P<0.01)。结论:hAECs能改善大鼠EAE的神经功能,减轻神经组织的免疫损伤,其机制可能主要与上调FoxP3+Treg和下调Th17细胞有关。

关键词：人羊膜上皮细胞实验性自身免疫性脑脊髓炎免疫调节大鼠

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人羊膜间充质干细胞对大鼠胶原性关节炎的疗效及免疫调节作用

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免疫学杂志 2013年第6期29卷 461-466页

作者：肖瑶方宁陈代雄余丽梅章涛赵春华遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室 563003 中国医学科学院基础医学研究所组织工程中心北京10005

目的探讨人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)对大鼠胶原性性关节炎(CIA)的疗效和免疫调节作用。方法从人羊膜分离培养hAMSCs,流式细胞术(FCM)分析其表型;用牛Ⅱ型胶原和弗氏佐剂诱导大鼠CIA模型;动物随机分为正常对照组、CIA模型组、hAMSCs治... 详细信息

目的探讨人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)对大鼠胶原性性关节炎(CIA)的疗效和免疫调节作用。方法从人羊膜分离培养hAMSCs,流式细胞术(FCM)分析其表型;用牛Ⅱ型胶原和弗氏佐剂诱导大鼠CIA模型;动物随机分为正常对照组、CIA模型组、hAMSCs治疗组、培养基对照组和氨甲蝶呤(MTX)治疗组,每组6只。hAMSCs治疗组经双踝关节腔注射2×106hAMSCs。观察关节炎指数(AI)、足趾容积、关节影像和病理变化以评价疗效;流式细胞术(FCM)检测外周血单个核细胞中淋巴细胞亚群百分比。结果与模型组和培养基组比较,hAMSCs治疗组和MTX治疗组AI和足趾容积均明显下降(P<0.05),踝关节关节骨质破坏和炎症反应减轻;Th1、Th2、Th17、CTL1、CTL2和NKT亚群百分比明显下降,而Foxp3+Treg细胞显著上调(P<0.01)。hAMSCs治疗组和MTX治疗组比较,淋巴细胞亚群的变化相似,但后者Foxp3+Treg细胞上调幅度不及前者(P<0.01)。结论 hAMSCs可能通过调节Foxp3+Treg和Th17细胞发挥对大鼠CIA的治疗作用。

关键词：人羊膜间充质干细胞胶原性关节炎免疫调节大鼠

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静脉移植人羊膜间充质干细胞改善大鼠心肌梗死后心功能

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基础医学与临床 2013年第12期33卷 1516-1522页

作者：方宁王钰莹陈代雄余丽梅章涛赵春华遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室贵州遵义563003 中国医学科学院基础医学研究所组织工程中心北京100005

目的探讨人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)静脉移植能否改善心肌梗死(MI)后心功能、减轻心肌纤维化和分化成心肌细胞。方法用流式细胞术和免疫组化染色对分离的hAMSCs进行表型分析和鉴定。结扎大鼠左冠状动脉前降支以建立MI模型,随机分为假... 详细信息

目的探讨人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)静脉移植能否改善心肌梗死(MI)后心功能、减轻心肌纤维化和分化成心肌细胞。方法用流式细胞术和免疫组化染色对分离的hAMSCs进行表型分析和鉴定。结扎大鼠左冠状动脉前降支以建立MI模型,随机分为假手术组、模型组对照组和hAMSCs移植组,每组12只。成模后1周,移植组经舌下静脉注射2×106BrdU标记的hAMSCs。用超声心动图检查心功能,用HE和Masson染色观察心肌组织病理,用免疫荧光双染色检测hAMSCs在MI区的存活及向心肌细胞分化的标志物。结果 1)移植后1、4和6周,hAMSCs组射血分数和左室短轴缩短率均显著高于模型组(P<0.01);舒张期左室前壁厚度和收缩期左室前壁厚度也都明显大于模型组(P<0.01,P<0.05);2)hAMSCs移植后6周,纤维化面积明显少于模型组(P<0.01);3)hAMSCs移植后6周,MI区BrdU阳性细胞表达心肌特异蛋白连接蛋白-43、α-辅肌动蛋白和结蛋白。结论 hAMSCs静脉移植能改善心肌梗死后心功能和心室重构,在心肌梗死原位可分化为心肌细胞。

关键词：人羊膜间充质干细胞心肌梗死移植分化心功能

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