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实验动物与药理学、毒理学研究学术交流会

作者：张伟冯娟陈炜张小娟袁树民廉虹张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的建立系统表达肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)的转基因动物模型,利用转基因动物模型研究HB-EGF与组织纤维化的关系。方法RT-PCR法克隆小鼠HB-EGF基因,将其插入Chickenβ-actin启动子下游,构建Chickenβ-actin-HB-EGF表达载体,利用... 详细信息

目的建立系统表达肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)的转基因动物模型,利用转基因动物模型研究HB-EGF与组织纤维化的关系。方法RT-PCR法克隆小鼠HB-EGF基因,将其插入Chickenβ-actin启动子下游,构建Chickenβ-actin-HB-EGF表达载体,利用显微注射的技术把表达载体注射到受精卵的雄原核中,建立HB-EGF转基因小鼠。利用特异引物PCR的方法鉴定转基因的基因型,采用Westem blotting方法鉴定HB-EGF基因在全身组织的表达。分别取HB-EGF转基因鼠与同窝阴性小鼠的肝、肾、肺及膀胱组织进行Massion染色。结果建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,Western blotting发现其HB-EGF在肝、肺、肾及膀胱的表达与同窝阴性对照小鼠相比明显增加。Massion染色结果表明转基因鼠肝、肺、肾及膀胱组织纤维化程度明显高于同窝阴性对照小鼠。结论成功建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,HB-EGF的过度表可显著加重组织纤维化程度。

关键词：肝素结合性表皮生长因子转基因小鼠纤维化

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YCZX01对cTnTR141W转基因扩张型心肌病模型的治疗作用及机理研究

YCZX01对cTnTR141W转基因扩张型心肌病模型的治疗作用及机理研究

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亚洲实验动物学会联合会（AFLAS）第三次会议暨中国实验动物学会（CALAS）第八届学术年会

作者：赵海平吕丹冯娟张丽张伟董伟秦川张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的观察YCZX01对遗传性扩张型心肌病模型的治疗作用,并研究其可能的药理机制。方法繁殖cTnT转基因扩张型心肌病小鼠,PCR法鉴定基因型,待小鼠到1.5月龄后进行心脏超声检测,根据体重、心功能将其分成三组:阴性鼠作为对照组,阳性鼠分为模... 详细信息

目的观察YCZX01对遗传性扩张型心肌病模型的治疗作用,并研究其可能的药理机制。方法繁殖cTnT转基因扩张型心肌病小鼠,PCR法鉴定基因型,待小鼠到1.5月龄后进行心脏超声检测,根据体重、心功能将其分成三组:阴性鼠作为对照组,阳性鼠分为模型组及YCZX01给药组（n=12）。将YCZX01（75mg/kg/d）放入动物饮水中,连续给药7个月。cTnT转基因小鼠在实验过程中有猝死,从给药开始记录各组的动物死亡数,七个月后用spss10.0统计软件进行生存率分析。每个月进行一次心脏超声检测,对左心室长轴M超结果进行分析,比较各组动物的心脏构型及心功能。给药7个月后,采用HE染色和Masson染色,光镜观察心脏的显微结构。透射电镜观察心肌的超微结构。RT-PCR法检测心脏缝隙连接蛋白Cx40、Cx43,钙粘蛋白N-cadherin、E-cadherin、P-cadherin,整合素Itga8、Itgb1bp3,成纤维生长因子FGF2以及ASK1的表达水平的变化。结果连续7个月的超声检测显示,cTnT转基因小鼠出现进行性的左心室扩张及收缩功能障碍。并有猝死发生;drug1减轻了扩心病小鼠的左心室扩张,改善了心功能,并降低了死亡率。心脏HE及Masson染色显示,cTnT转基因小鼠有心肌细胞的不均匀肥大及间质胶原的增生,透射电镜结果显示,cTnT转基因小鼠发生线粒体肿胀、嵴断裂,肌浆网扩张,闰盘连接破坏;YCZX01改善了心脏的结构。cTnT转基因小鼠心脏缝隙连接蛋白Cx40的表达降低,钙粘蛋白E-cadherin、P-cadherin的表达增加,整合素Itga8、Itgb1bp3的表达增加,成纤维生长因子FGF2及ASK1的表达增加,Cx43、N-cadherin的表达没有显著的变化。Drug1提高了Cx40的表达,降低了E-cadherin、P-cadherin、Itga8、Itgb1bp3的表达,降低了FGF2、ASK1的表达。结论 YCZX01对cTnT转基因扩张型心肌病小鼠有治疗作用,可能部分通过抑制FGF2、ASK1的表达发生作用。

关键词： YCZX01 遗传性扩张型心肌病治疗

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肝素结合类表皮生长因子参与DCM模型小鼠心脏间质纤维化

肝素结合类表皮生长因子参与DCM模型小鼠心脏间质纤维化

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亚洲实验动物学会联合会（AFLAS）第三次会议暨中国实验动物学会（CALAS）第八届学术年会

作者：冯娟彭健豪张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的探讨肝素结合类表皮生长因子对DCM模型小鼠心脏间质纤维化的作用。方法 Western blotting检测野生型和DCM模型小鼠心脏中HB-EGF的表达,H&E和Masson染色检测DCM模型小鼠心脏组织学,Realtime PCR检测DCM模型小鼠心脏Ⅰ型胶原和Ⅲ... 详细信息

目的探讨肝素结合类表皮生长因子对DCM模型小鼠心脏间质纤维化的作用。方法 Western blotting检测野生型和DCM模型小鼠心脏中HB-EGF的表达,H&E和Masson染色检测DCM模型小鼠心脏组织学,Realtime PCR检测DCM模型小鼠心脏Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达。显微注射法建立HB-EGF转基因C57BL/6J小鼠,PCR鉴定基因表型,Western blotting检测表达水平。病理检测HB-EGF转基因小鼠心脏的组织学,Realtime PCR检测HB-EGF转基因小鼠心脏Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达。原代培养C57BL/6J小鼠心肌成纤维细胞,重组人HB-EGF(10ng/ml)刺激心肌成纤维细胞后,BrdU免疫组织化学法检测心肌成纤维细胞的增殖,Realtime PCR检测Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达,Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs),ERK1/2和JNK信号通路的变化。结果野生型小鼠心脏HB-EGF的表达随月龄增加而逐渐降低,而DCM转基因小鼠心脏中HB-EGF随月龄增加病情加重而增加,并伴随有间质纤维化以及Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达增加(1.7倍和1.6倍)。用HB-EGF转基因小鼠研究HB-EGF的功能,发现HB-EGF可增加心脏间质纤维化,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达(1.8倍)。用重组人HB-EGF刺激原代培养心肌成纤维细,30 min即引起Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达显著增加,24h引起心肌成纤维细胞明显增殖,10 min即可引起ERK1/2,JNK磷酸化水平增加。结论结果证实HB-EGF参与DCM模型小鼠心脏间质纤维化。HB-EGF促进Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达,可能通过MAPKs信号通路发挥上述作用。

关键词：肝素结合类表皮生长因子转基因模型心肌细胞成纤维细胞丝裂原活化蛋白激酶

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人宫颈癌细胞HeLa移植模型肿瘤生长的荧光分析和卡尺测量的比较

人宫颈癌细胞HeLa移植模型肿瘤生长的荧光分析和卡尺测量的比较

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实验动物与药理学、毒理学研究学术交流会

作者：李小颖马春梅张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白的人宫颈癌细胞系,建立移植瘤模型并比较移植模型肿瘤生长的荧光分析和卡尺测量的优缺点。方法以Lipofectamine 2000介导chickenβ-actin-GFP-NEO转染人宫颈癌细胞Hela,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达绿... 详细信息

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白的人宫颈癌细胞系,建立移植瘤模型并比较移植模型肿瘤生长的荧光分析和卡尺测量的优缺点。方法以Lipofectamine 2000介导chickenβ-actin-GFP-NEO转染人宫颈癌细胞Hela,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养。BALB/CA-nu裸鼠皮下接种1×10～6个发光细胞使其成瘤,利用活体荧光成像系统和游标卡尺观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达GFP的人宫颈癌细胞株,将其接种到裸鼠体内可成瘤。活体荧光成像观察发现,1至3周随着肿瘤体积逐渐增大,平均荧光光子数逐渐增加;4周时随着肿瘤出现明显坏死,平均荧光光子数呈现下降趋势,而游标卡尺测量结果显示肿瘤在4至5周仍然不断的增大。结论绿色荧光蛋白能够在人宫颈癌细胞Hela中长期稳定表达,用绿色荧光蛋白标记的人宫颈癌细胞Hela建立的裸鼠肿瘤模型可以为人宫颈癌研究提供理想的实验材料,应用小动物活体成像系统能够客观定量评价活的肿瘤细胞在动物体内的生长情况,而不是肿瘤体积的变化。

关键词：人宫颈癌细胞裸小鼠活体荧光成像系统,游标卡尺

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cTnTR92Q转基因小鼠肥厚型心肌病模型的建立

cTnTR92Q转基因小鼠肥厚型心肌病模型的建立

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亚洲实验动物学会联合会（AFLAS）第三次会议暨中国实验动物学会（CALAS）第八届学术年会

作者：董伟冯娟祝梅香全雄志张伟秦川张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的建立cTnT肥厚型心肌病的转基因小鼠模型。方法把cTnT基因插入α-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立cTnT转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定cTnT转基因小鼠的基因表型,RT-PCR检测基因表达,光学显微镜和超声检测cTnT转... 详细信息

目的建立cTnT肥厚型心肌病的转基因小鼠模型。方法把cTnT基因插入α-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立cTnT转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定cTnT转基因小鼠的基因表型,RT-PCR检测基因表达,光学显微镜和超声检测cTnT转基因小鼠心脏的病理改变。结果建立了3个不同表达水平的cTnT转基因小鼠品系。转入的cTnT基因在心脏组织的表达水平高于内源性cTnT。组织学分析显示cTnT转基因小鼠心脏变大,心室壁肥厚,心腔变小,心肌细胞排列紊乱,心肌间质纤维增多。超声检查显示心室壁变厚,收缩期容积和舒张期容积显著缩小,射血分数、短轴缩短率明显增加。结论 cTnT转基因小鼠心脏变大,室壁变厚,心腔变小,心肌细胞排列紊乱,间质纤维化以及心肌舒张功能失调,说明成功建立了cTnT转基因小鼠肥厚型心肌病模型,为研究肥厚型心肌病发病机制和药物研发提供了有价值的动物模型。

关键词：心肌肌钙蛋白T 肥厚型心肌病转基因模型基因突变

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猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)恒河猴适应株耐9-(2-磷酸甲氧丙基)腺嘌呤(PMPA)突变位点筛查

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中国比较医学杂志 2013年第10期23卷 44-48,57页

作者：王卫鞠斌丛喆董志会陈霆杜文达蒋虹魏强北京协和医学院比较医学中心中国医学科学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室北京100021

目的初步明确猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)耐9-(2-磷酸甲氧丙基)腺嘌呤(PMPA)突变基因位点,指导SIV/恒河猴模型在药物评价中的应用。方法 SIVmac239恒河猴适应株感染恒河猴,之后进行PMPA治疗,测定不同时间点血浆病毒载量和外周血CD4+T细胞... 详细信息

目的初步明确猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)耐9-(2-磷酸甲氧丙基)腺嘌呤(PMPA)突变基因位点,指导SIV/恒河猴模型在药物评价中的应用。方法 SIVmac239恒河猴适应株感染恒河猴,之后进行PMPA治疗,测定不同时间点血浆病毒载量和外周血CD4+T细胞数;使用CEMx174细胞进行药物敏感实验。单拷贝PCR测定病毒rt基因变异情况。结果 PMPA治疗不能有效降低感染猴血浆病毒载量,且对血CD4+T细胞数没有显著影响;细胞水平药物敏感实验证实该病毒株对PMPA不敏感。序列比对发现S205L和M502I可能影响到病毒对PMPA的药物敏感性。结论本研究为SIV/恒河猴模型的合理使用及HIV-1的临床治疗提供了信息。

关键词： SIVmac239 PMPA rt基因耐药位点

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动物与新发传染病

动物与新发传染病

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中国科协第179次青年科学家论坛——传染病病原体变异和致病机制

作者：秦川中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

野生动物源性传染性人兽共患病作为新发传染病已经成为威胁人类健康的重要因素。对人类健康造成了巨大的全球负担，其确切程度尚难统计。作者介绍了新发对传染病的种类，并对流行病学和新发传染病与野生动物的关系进行了详细的分析，同... 详细信息

野生动物源性传染性人兽共患病作为新发传染病已经成为威胁人类健康的重要因素。对人类健康造成了巨大的全球负担，其确切程度尚难统计。作者介绍了新发对传染病的种类，并对流行病学和新发传染病与野生动物的关系进行了详细的分析，同时，还对新发传染病的防治作了展望。

关键词：新发传染病流行病学野生动物

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Dkk3转基因模型

Dkk3转基因模型

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亚洲实验动物学会联合会（AFLAS）第三次会议暨中国实验动物学会（CALAS）第八届学术年会

作者：吕丹冯娟赵海平张丽张伟董伟秦川张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的为在体内研究Dkk3对心脏功能的影响而建立心脏特异的Dkk3转基因小鼠。背景WNT家族WNT1、WNT3a、WNT8等成员对心脏发育具有重要的作用,Dkk3作为Wnt通路拮抗剂Dickkopf(Dkk)家族成员之一,目前发现其与肿瘤发生发展,细胞保护、凋亡等... 详细信息

目的为在体内研究Dkk3对心脏功能的影响而建立心脏特异的Dkk3转基因小鼠。背景WNT家族WNT1、WNT3a、WNT8等成员对心脏发育具有重要的作用,Dkk3作为Wnt通路拮抗剂Dickkopf(Dkk)家族成员之一,目前发现其与肿瘤发生发展,细胞保护、凋亡等病理进程关系密切,但对于Dkk3对心脏及心血管系统的生物学功能所知甚少,本研究特建立心脏特异的Dkk3转基因小鼠,为研究Dkk3对心脏功能的影响提供病理模型工具。方法利用基因克隆技术,构建α-MHC-m-Dkk3表达载体,经酶切及序列测序鉴定后,通过显微注射将制备好的片段注入受精卵,将注射后存活的受精卵移入ICR假孕母鼠,产下的仔鼠经聚合酶链反应(PCR)筛选出整合有外源目的基因的阳性转基因鼠;对转基因小鼠心脏组织RNA行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及RNA印迹(Northern blot)分析,检测Dkk3在转基因小鼠心脏中的表达水平;对转基因小鼠心脏进行超声波分析,观察转基因小鼠心脏结构形态及功能的变化情况;利用光镜观察转基因小鼠心脏整体结构形态及心肌细胞、胶原纤维等显微结构的改变;利用光镜观察转基因小鼠左心房及左心室等部位心肌纤维、肌质网及线粒体等超微结构的改变。结果重组质粒α-MHC-m-Dkk3中α-MHC启动子及Dkk3 cDNA序列正确,假孕鼠所产仔鼠经PCR检测,检出15只首建鼠;依RT-PCR和Northern blot分析结果筛出高、中、低不同表达水平的3个首建鼠用于其他实验研究;超声波检查发现Dkk3于心脏中过表达可引起转基因小鼠左心室心壁变厚,左心室心腔缩小,心重指数增加,射血分数增加,心肌收缩力增强等改变;光镜观察转基因小鼠整体心脏HE、Masson染色,可见左心室心腔及心肌细胞间间隙变小,心肌细胞增大等改变;电镜观察转基因小鼠心脏超微结构发现其心肌纤维排列轻度紊乱,肌质网轻度扩张,线粒体有增生等改变。结论 Dkk3对心脏的正常生理功能具有重要的影响,α-MHC-m-Dkk3转基因小鼠系的建立为深入研究Dkk3对心脏功能的影响提供了病理模型。

关键词： Dkk3转基因心脏模型

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19种抗禽类IgY多克隆抗体的制备和标记

19种抗禽类IgY多克隆抗体的制备和标记

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亚洲实验动物学会联合会（AFLAS）第三次会议暨中国实验动物学会（CALAS）第八届学术年会

作者：杨帆林树柱刘先菊秦川张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的本课题的主要目标是纯化与人类关系密切的禽类一级抗体作为抗原,制备HRP-标记的抗多种二级抗体,建立多种动物血清学检测体系。以解决动物病原血清学检测体系不完备的问题。方法采集了19种与人类关系密切的禽类蛋或血清,用水稀释法,H... 详细信息

目的本课题的主要目标是纯化与人类关系密切的禽类一级抗体作为抗原,制备HRP-标记的抗多种二级抗体,建立多种动物血清学检测体系。以解决动物病原血清学检测体系不完备的问题。方法采集了19种与人类关系密切的禽类蛋或血清,用水稀释法,HiTrap IgY Purification HP免疫亲和层析法,PEG沉淀,阴离子交换层析,硫酸铵分级沉淀法等纯化了不同鸟类的IgY,并用纯化的IgY作为抗原制备抗血清。Protein-A亲和纯化兔抗IgY血清IgG。使用改良过碘酸钠法制备酶结合物。ELISA检测酶标抗体的工作浓度,western blotting检测酶标抗体的特异性。结果应用改良的硫酸铵沉淀法纯化获得鹅、鸬鹚、鸵鸟、富贵鸟、鸽子、大雁IgY。应用嗜硫性亲和层析和无机盐沉淀法纯化获得孔雀、鹌鹑、贵妃鸡、夜鹭、草鹭IgY。应用切胶法获得赤嘴潜鸭、燕鸥、长脚鹬、虎皮鹦鹉、翘鼻麻鸭、麻雀IgY。共19种鸟类的IgY。本研究制备了17种辣跟过氧化物酶标记的兔抗禽IgY抗体。用纯化的鸬鹚IgY、鸽子IgY、鹌鹑IgY、鹅IgY、草鹭IgY作抗原,制备的抗血清与未纯化卵黄样品的western blotting分析,形成特异的重链和轻链条阳性条带,具有很高的特异性。用过碘酸钠法标记兔抗禽IgY抗体,获得了HRP标记的抗体,用直接ELISA方法检测抗体的最适工作浓度。兔抗草鹭IgY-HRP、兔抗鹌鹑IgY-HRP、兔抗麻雀IgY-HRP、兔抗鸽子IgY-HRP、兔抗大雁IgY-HRP的最适ELISA工作浓度为1:1000。兔抗鸵鸟IgY-HRP、兔抗夜鹭IgY-HRP、兔抗鸬鹚IgY-HRP的ELISA最适工作浓度可以达到1:10000。结论获得了优质可靠的兔抗麻雀IgY-IgG酶标抗体。为鸟类的血清学检测体系建立了初步资源。

关键词：新发传染病禽类 IgY 抗IgY HRP

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FKBP52对小鼠前列腺发育的影响

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中国比较医学杂志 2013年第6期23卷 63-66,I0010,F0003页

作者：邵思源邓然杨志伟雍伟东中国医学科学院医学实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室北京100021

目的通过FKBP52基因敲除小鼠模型探索FKBP52在小鼠前列腺发育过程中的作用。方法分别对胚胎第17.5天、新生的和出生后3周的野生型和FKBP52基因敲除小鼠的前列腺进行切片HE染色,观察不同发育时期里野生型和FKBP52基因敲除小鼠前列腺发育... 详细信息

目的通过FKBP52基因敲除小鼠模型探索FKBP52在小鼠前列腺发育过程中的作用。方法分别对胚胎第17.5天、新生的和出生后3周的野生型和FKBP52基因敲除小鼠的前列腺进行切片HE染色,观察不同发育时期里野生型和FKBP52基因敲除小鼠前列腺发育的异同。结果 (1)小鼠前列腺发育的起始不依赖于FKBP52基因的参与;(2)随着胚胎的发育,FKBP52在雄鼠前列腺发育中的作用逐渐显现出来,即FKBP52的缺失会导致前列腺叶发育受阻,最终不能形成成熟的前列腺。结论 FKBP52在小鼠前列腺的发育过程中具有重要作用,它不参与前列腺的发育起始过程,但其缺失会导致前列腺发育受阻,即不能形成成熟的前列腺。

关键词： FKBP52 前列腺发育

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