目的比较静态冷保存(SCS)和常温机械灌注(NMP)对猪离断肢体骨骼肌的保护作用。方法选取长白猪4头,截取8只离断肢体,按随机数字表法分为SCS组(5只)和NMP组(3只)。颈动脉取血后于肩胛骨⁃肱骨关节处离断,建立离断肢体模型。SCS组离断肢体使用无菌布巾包裹后放入4℃环境中保存24 h。NMP组离断肢体使用含血红细胞灌注液于37℃下机械灌注24 h,每6 h更换70%灌注液。NMP组实验前采用盐水介质交叉配血法检测供受体猪血液凝集情况以评估其血液安全性,制备同种异体血红细胞灌注液并检测灌注液pH、Na^(+)、K^(+)、Cl^(-)、Ca^(2+)、葡萄糖(Glu)、红细胞压积(Hct)、乳酸(Lac)和渗透压水平情况。灌注0、6、12、18、24 h,监测NMP组皮肤温度和血氧饱和度(SaO2),并通过检测灌注液pH、Glu、肌酸激酶(Ck)、K^(+)、Ca^(2+)、Na^(+)水平以评估离断肢体骨骼肌代谢情况。灌注0、24 h,取NMP组和SCS组离断肢体骨骼肌行HE染色、TUNEL染色,分别对平均细胞间距离和肌细胞凋亡指数进行量化分析,观察组织病理学变化情况。灌注结束后比较NMP组和SCS组离断肢体增重率,评估其肿胀程度,观察离断肢体状态。结果供受体猪血液交叉配型试验为阴性。制备的含血红细胞灌注液pH(7.38±0.04)、Na^(+)[(138.30±4.48)mmol/L]、K^(+)[(3.50±0.26)mmol/L]、Glu[(6.11±2.08)mmol/L]、渗透压[(305.67±3.79)mmol/L]等指标基本维持在正常范围,但Cl^(-)[(118.34±12.00)mmol/L]、Ca^(2+)[(2.00±0.15)mmol/L]略高于正常参考范围,Hct(0.30±0.03)、Lac[(1.54±0.38)mmol/L]均低于正常参考范围。离断肢体灌注期间,NMP组平均皮肤温度为(36.13±0.98)℃,其中灌注6、12、18、24 h皮肤温度均较0 h明显升高(P<0.01),而灌注6、12、18、24 h皮肤温度差异均无统计学意义(P>0.05);NMP组皮肤平均SaO2均为95%以上,其中灌注0、12、18、24 h皮肤SaO2差异均无统计学意义(P>0.05),而灌注6 h SaO2较0 h显著升高(P<0.05)。灌注0、6、12、18、24 h NMP组灌注液pH、Glu、Na^(+)、Ca^(2+)水平差异均无统计学意义(P>0.05);灌注18、24 h Ck水平均较6 h显著升高,且6、12、18、24 h Ck水平均较0 h明显升高(P<0.05);K^(+)水平随灌注时间延长逐渐升高,且灌注18、24 h K^(+)水平均较0 h显著升高(P<0.05)。HE染色结果显示,0 h NMP组和SCS组骨骼肌肌纤维连续性好且排列规则,细胞间距离均为(8.95±0.60)μm;24 h NMP组骨骼肌肌纤维有少部分断裂,肌纤维稍有肿胀,间隙稍增宽,细胞间距离为(14.75±0.90)μm,较同组0 h显著增大(P<0.01);24 h SCS组骨骼肌肌纤维明显断裂、肿胀,间隙明显变宽,细胞间距离为(23.51±1.49)μm,较同组0 h和NMP组24 h显著增大(P<0.01)。TUNEL免疫荧光染色结果显示,0 h NMP组和SCS组骨骼肌含有微量凋亡细胞,凋亡细胞指数均为(4.26±1.62)%;24 h NMP组骨骼肌含有少量凋亡细胞,凋亡细胞指数为(25.94±2.69)%,较同组0 h显著升高(P<0.01)。24 h SCS组骨骼肌含有大量凋亡细胞,凋亡细胞指数为(62.97±3.22)%,较同组0 h和24 h NMP组显著升高(P<0.01)。与SCS组离断肢体比较,灌注24 h NMP组皮肤颜色红润,皮下层稍有水肿,未出现缺血性肌挛缩症状,关节活动良好。24 h NMP组离断肢体增重率为(15.82±0.89)%,显著高于24 h SCS组的(0.97±0.28)%(P<0.01)。结论与SCS相比,利用同种异体血制备的含血红细胞灌注液对猪离断肢体进行NMP,可通过持续稳定供能供氧、平衡离子稳态和灌注液酸碱度维持骨骼肌代谢,减轻肌纤维缺血性损伤及抑制肌细胞凋亡。
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