目的利用非代谢途径直接将外源小分子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)转染进入细胞内的方法。方法对比3种不同转染试剂(X-tremeGENE TM HP DNA、Lipofectamine TM RNAiMAX和Lipofectamine TM 2000)将NADPH转染到人骨肉瘤细胞系U2OS和...
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目的利用非代谢途径直接将外源小分子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)转染进入细胞内的方法。方法对比3种不同转染试剂(X-tremeGENE TM HP DNA、Lipofectamine TM RNAiMAX和Lipofectamine TM 2000)将NADPH转染到人骨肉瘤细胞系U2OS和小鼠胚胎成纤维细胞系3T3L1中的效果,并通过油红O染色比较它们对脂肪细胞分化的影响。结果用X-tremeGENE HP DNA转染试剂转染NADPH可以有效提高细胞内NADPH水平(P<0.001)。随着NADPH转染浓度(10μmol/L NADPH与10μL转染试剂)的增加,细胞中的NADPH水平呈剂量依赖性增加。此外使用3种转染试剂在3T3L1前脂肪细胞中转染NADPH,只有使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂转染NADPH的脂肪细胞分化更明显(P<0.001)。结论X-tremeGENE HP DNA转染试剂能够成功地将外源NADPH转染进入细胞内,并促进3T3L1脂肪细胞的分化和脂质积累。
泛素化是一种动态可逆的蛋白质翻译后修饰,泛素分子在泛素激活酶、泛素结合酶和泛素连接酶的级联酶促反应催化下共价连接到底物蛋白上。去泛素化酶将泛素分子从底物上移除,动态可逆地调控泛素化修饰,在成熟泛素的生成、泛素链的移除与修剪、游离泛素链的回收等过程中发挥着关键的调控作用。本文的研究对象是酵母中泛素特异性蛋白酶(ubiquitin specific protease,USP)家族成员Ubp14,负责回收细胞内游离的泛素链。本研究定量比较了酵母细胞中Ubp14缺失对全蛋白质组的影响,进而找出其潜在的调控通路和分子功能。首先,通过同源重组技术构建了ubp14△菌株,发现其生长速度低于野生型酵母。利用稳定同位素氨基酸代谢标记技术结合深度覆盖的蛋白质组学分析技术,系统比较了ubp14△菌株相对于野生型菌株的差异蛋白,共计鉴定3685个蛋白,通过统计学分析筛选得到109个差异蛋白。基因本体论分析发现,Ubp14缺失引起的差异蛋白主要参与了包括氨基酸代谢、氧化还原和热应激等生物学过程。本研究为深入探究去泛素化酶Ubp14的生物学功能,进而深刻理解游离泛素的稳态平衡与生物学过程调控提供了高可信的蛋白质组学数据信息。
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