检索结果-内蒙古大学图书馆

遗传 2013年第4期35卷 529-532页

作者：刘新星张雨田张博北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室北京100871

斑马鱼心脏再生是近年来心血管再生医学研究的新热点之一,也是以斑马鱼为模式进行脊椎动物遗传发育研究的一个新的重要方向。通过了解斑马鱼成体心脏再生的过程和研究其分子和细胞机制有可能为诱导哺乳动物成体心脏再生、治疗心肌梗塞... 详细信息

斑马鱼心脏再生是近年来心血管再生医学研究的新热点之一,也是以斑马鱼为模式进行脊椎动物遗传发育研究的一个新的重要方向。通过了解斑马鱼成体心脏再生的过程和研究其分子和细胞机制有可能为诱导哺乳动物成体心脏再生、治疗心肌梗塞等人类心脏疾病提供理论依据。文章主要介绍通过简单的手术切除成体斑马鱼约20%心室造成成体心脏损伤、诱导心脏再生的操作方法与经验。其基本流程主要包括麻醉成鱼、在体视镜下用尖镊撕开斑马鱼心脏腹面的皮肤和心包膜以暴露心脏、用剪刀切除心尖区域的部分心室。这种方法的手术成功率可达90%以上,操作简便且重复性好,是目前研究斑马鱼成体心脏损伤-再生的最常用的方法。

关键词：斑马鱼心脏手术切除再生

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《遗传》与中国斑马鱼遗传发育研究共同迎接机遇与挑战

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遗传 2013年第4期35卷 393-394页

作者：张博李绍武北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室北京100871 中国科学院遗传与发育生物学研究所北京100101

2012年9月，《遗传》杂志出版了“斑马鱼遗传发育研究专刊（上）”，首次系统总结了本世纪10余年来中国斑马鱼遗传发育研究领域的发展历程与现状到，展示了我国科研工作者在斑马鱼基础理论和方法学研究等方面最新的原创性工作，介绍了... 详细信息

2012年9月，《遗传》杂志出版了“斑马鱼遗传发育研究专刊（上）”，首次系统总结了本世纪10余年来中国斑马鱼遗传发育研究领域的发展历程与现状到，展示了我国科研工作者在斑马鱼基础理论和方法学研究等方面最新的原创性工作，介绍了该领域的国内外研究进展与热点。在此基础上，本期专刊的选题进一步向深度和广度拓展，

关键词：《遗传》斑马鱼发育中国基础理论科研工作者原创性方法学

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以斑马鱼为模式研究脊椎动物组织器官发育机制与构建人类疾病模型

以斑马鱼为模式研究脊椎动物组织器官发育机制与构建人类疾病模型

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2013年北京亦庄生物医药园产业创新与发展论坛第八期活动暨第一届模式动物与生物医学研究会

作者：徐琳杰吴谦侯华芸韩宇翔高巍戚飞张博北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室北京 100871

斑马鱼是研究心血管、胰腺等组织器官发育与再生机制以及构建人类疾病模型的理想模式脊椎动物之一.本实验室从大规模遗传筛选人手，一方面通过Tol2转座子介导的增强子诱捕筛选组织器官特异标记的转基因鱼系以及组织器官特异性表达的基... 详细信息

斑马鱼是研究心血管、胰腺等组织器官发育与再生机制以及构建人类疾病模型的理想模式脊椎动物之一.本实验室从大规模遗传筛选人手，一方面通过Tol2转座子介导的增强子诱捕筛选组织器官特异标记的转基因鱼系以及组织器官特异性表达的基因，获得了国际首例GFP特异标记单胺类神经元的转基因斑马鱼，可用于帕金森症的基础理论与应用研究;另一方面通过反转录病毒插入诱变筛选斑马鱼突变体，构建模拟人类疾病的斑马鱼模型.我们已筛选到跟Alagille综合征(动脉-肝脏发育不良综合征)、成骨不全症(玻璃娃娃)、神经嵴发育不良(neurocristopathy)、先天性角化不良、卟啉症、腺苷酸琥珀酸裂解酶缺陷(ADSL deficiency)等人类疾病相关的斑马鱼突变体.最近，我们利用本实验室创建的TALEN基因组定点突变技术制备了斑马鱼pdx1突变体，通过分析胰腺发育主控基因的功能比较斑马鱼与哺乳动物胰腺发育机制的异同.结果表明，斑马鱼pdx1仅特异地调控β细胞和胰腺导管的分化，而并非像在哺乳动物中那样决定所有胰腺组织的分化.pdx1突变体呈现出血糖升高和身体消瘦等糖尿病表征.在少数能生长至成年的pdx1突变体中，胰腺出现了明显的纤维化，并引发肝脏中出现胆汁淤积和脂肪化的表型.斑马鱼pdx1突变体提供了一个非药物导致的糖尿病模型.

关键词：斑马鱼器官发育疾病模型遗传筛选 TALEN

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Pdx1在斑马鱼胰腺发育中的功能研究

Pdx1在斑马鱼胰腺发育中的功能研究

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第三届全国斑马鱼研究大会

作者：徐琳杰吴谦侯华芸韩宇翔高巍戚飞朱作言张博北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室北京100871

：目前的研究表明斑马鱼和小鼠在胰腺发育机制与信号通路上存在一些差异,同时,哺乳动物胰腺上皮分化和形成决定因子Pdx1(pancreatic and duodenal homeobox 1)在斑马鱼中同源基因的功能尚不明确.本研究利用TALEN 技术制备了斑马鱼pdx1 ... 详细信息

：目前的研究表明斑马鱼和小鼠在胰腺发育机制与信号通路上存在一些差异,同时,哺乳动物胰腺上皮分化和形成决定因子Pdx1(pancreatic and duodenal homeobox 1)在斑马鱼中同源基因的功能尚不明确.本研究利用TALEN 技术制备了斑马鱼pdx1 突变体,通过分析胰腺发育主控基因的功能比较斑马鱼与哺乳动物胰腺发育机制的异同.pdx1 突变体中胰腺β 细胞的数目显著下降;遗传学实验结果表明,pdx1 通过作用于RA(retinoic acid)信号通路下游调控β 细胞的分化和形成.然而,pdx1 突变体中胰腺内分泌腺其它细胞类型的分化未受显著影响,除胰岛素之外的其它激素的表达水平也没有明显变化;突变体中胰腺内分泌腺前体细胞也能够正常形成,且成熟胰岛的细胞数目在整体上无明显变化,胰岛中存在发育阻滞而未能分化为β 细胞的祖细胞.此外,pdx1 突变体中胰腺外分泌腺的腺泡细胞发育未受显著影响,然而导管则出现缺失或明显缺陷.上述结果表明,pdx1 在斑马鱼中与其在小鼠中的功能存在较大区别：斑马鱼pdx1 仅特异地调控β 细胞和胰腺导管的分化,而在小鼠中Pdx1 则决定所有胰腺组织的分化.这表明斑马鱼胰腺发育机制与小鼠相比有一定差异,为利用斑马鱼研究胰腺发育的侧重点提供了新的线索.在生理水平上,pdx1 突变体呈现出血糖升高和身体消瘦等糖尿病表征.在少数能生长至成年的pdx1 突变体中,胰腺出现了明显的纤维化,并引发肝脏中出现胆汁淤积和脂肪化的表型.这表明Pdx1 对于维持胰腺器官的正常生理功能是必需的,斑马鱼pdx1 突变体提供了一个非药物导致的糖尿病模型.

关键词：斑马鱼胰腺 β细胞 pdx1

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嘌呤从头合成途径对斑马鱼早期胚胎发育作用的研究

嘌呤从头合成途径对斑马鱼早期胚胎发育作用的研究

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第三届全国斑马鱼研究大会

作者：徐琳杰韩宇翔高巍侯华芸朱作言张博北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室北京100871

相对于人们对嘌呤合成生化途径的精细研究,嘌呤在发育过程中的作用少有报道.通过反转录病毒插入诱变,本研究筛选到一个影响嘌呤从头合成途径的斑马鱼突变体Vz121.在该突变体中,反转录病毒插入在pfas(phosphoribosylformylglycinamidine ... 详细信息

相对于人们对嘌呤合成生化途径的精细研究,嘌呤在发育过程中的作用少有报道.通过反转录病毒插入诱变,本研究筛选到一个影响嘌呤从头合成途径的斑马鱼突变体Vz121.在该突变体中,反转录病毒插入在pfas(phosphoribosylformylglycinamidine synthase)基因的第一个内含子中,导致该基因表达量显著下降.在pfas 合子基因表达缺失的突变体中,色素细胞的形成不受影响,但由于缺乏嘌呤作为色素的前体分子而导致黄色素和彩虹色素合成量显著降低,同时突变体胚胎的眼睛偏小.合子pfas 表达缺失的突变体可以长至成鱼,并且随着食物中嘌呤的补给,色素缺失、眼睛偏小的表型逐渐恢复至正常.当pfas 表达量极低(母源和合子表达同时缺失)时,则会导致胚胎细胞增殖水平降低、凋亡增多,其中头部的凋亡尤为明显,从而导致中脑变小和后脑脑室结构异常等发育缺陷,突变体最终无法存活.这样的发育缺陷可以通过向早期胚胎中注射IMP(inosine monophosphate,次黄嘌呤单核苷酸)或抑制凋亡促进增殖的因子birc5a(baculoviral IAP repeat-containing 5a)的mRNA 进行挽救.上述结果表明,胚胎早期嘌呤供应量充足与否对胚胎脑部发育至关重要,这为人类中嘌呤从头合成途径缺陷导致的面颅部发育异常及相关的神经疾病提供了可能的解释和治疗思路.

关键词：嘌呤从头合成途径母源表达后脑 birc5a

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大众化的基因组定点修饰技术——从TALEN到CRISPR/Cas系统

大众化的基因组定点修饰技术——从TALEN到CRISPR/Cas系统

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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：刘达王展翔肖安张雨田李文渊祖尧姚少华林硕张博北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室美国加州大学洛杉矶分校分子、细胞与发育生物学系

近年来,以锌指核酸酶（ZFN）和TALEN为代表的人工构建的序列特异性核酸内切酶为基因组定点修饰技术带来了革命性的飞跃,使原来只能在小鼠、果蝇等极少数物种中实现的基因打靶迅速扩展到多种实验材料。本实验室在斑马鱼中建立了一系列基... 详细信息

近年来,以锌指核酸酶（ZFN）和TALEN为代表的人工构建的序列特异性核酸内切酶为基因组定点修饰技术带来了革命性的飞跃,使原来只能在小鼠、果蝇等极少数物种中实现的基因打靶迅速扩展到多种实验材料。本实验室在斑马鱼中建立了一系列基于TALEN的基因组靶向修饰技术,可用于制备多种类型、可稳定遗传的突变体,例如在特定位点高效诱导indel突变、通过同源重组实现基因敲入,还能够利用两对TALEN进行染色体大片段的靶向删除或倒位,最大可达1 Mbp。最近,陆续在体外培养的人类细胞系以及斑马鱼、果蝇等一些模式生物中报道了一种更为简便的基因打靶技术。该技术利用了一种在细菌及古细菌中普遍存在的、称为CRISPR/Cas系统的防御机制。其中Cas9蛋白以及与其相互作用的向导RNA（guide RNA,简称gRNA）构成了一个简单的CRlSPR/Cas系统,Cas9经过密码子优化等改造之后,通过跟gRNA相互配合,能够靶向切割特异的双链DNA,从而造成基因组定点突变。gRNA通过碱基互补配对识别并结合靶序列,Cas9蛋白则作为核酸内切酶起作用。然而,作为一种非常有前途的新型基因组靶向突变工具,至今在斑马鱼中还未见报道获得可通过生殖细胞向后代遗传的突变体。同时,对这种基因打靶工具的特异性及其脱靶现象的分析也刚刚起步,尚无在个体水平检测其脱靶效应的报道。此外,也没有在斑马鱼中优化Cas9密码子的报道。我们首先检测了Cas9/gRNA在酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,th）基因造成的突变的种系传递情况,结果表明,4/14的F鱼携带可遗传的突变,嵌合率由12%到22%不等,显示Cas9/gRNA所产生的突变能够稳定遗传。随后,本实验室根据斑马鱼的密码子偏好性构建了一种新的Cas9表达载体（zCas9）,结果显示它在斑鱼中比已报道的根据人类密码子优化的Cas9（humanized Cas9,简称hCas9）显示出更高的诱变效率。我们选择了11个不同的位点比较了这两种Cas9,结果显示zCas9在所有这些位点上的诱变效率均高于hCas9。为了检验Cas9/gRNA系统的特异性,我们开发了一个可以在任意己知基因组中寻找潜在脱靶位点的程序。利用这个程序,我们在斑马鱼全基因组中预测了一个效率相对较高的靶点（CNT05,效率约为95%）的潜在脱靶位点,并选择了21个脱靶位点进行了深入分析。PCR扩增以及深度测序结果表明,该位点并没有明显的脱靶效应。综合上述结果,我们的数据表明,基于zCas9的Cas9/gRNA系统在斑马鱼中足一种高效、高特异性的基因打靶工具。

关键词： CRISPR/Cas zCas9 斑马鱼基因打靶脱靶效应

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斑马鱼精子冻存与复苏实验方法与流程

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遗传 2012年第9期34卷 1211-1216页

作者：郑乃中张博北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室北京100871

斑马鱼是研究胚胎发育及其遗传机制的重要模式脊椎动物。目前人们已经积累了大量的突变体和转基因鱼系,如何安全、妥善地长期保存这些品系是每一个研究斑马鱼的实验室都会面临的问题。精子冻存与复苏技术是目前最为简单有效的一种长期... 详细信息

斑马鱼是研究胚胎发育及其遗传机制的重要模式脊椎动物。目前人们已经积累了大量的突变体和转基因鱼系,如何安全、妥善地长期保存这些品系是每一个研究斑马鱼的实验室都会面临的问题。精子冻存与复苏技术是目前最为简单有效的一种长期保存斑马鱼遗传品系的方法。应用这一技术不仅可以节省大量的鱼房空间与人力、物力,使鱼系的使用与保存更加灵活和持久,更重要的是能够防止珍贵鱼系的意外丢失,为鱼系保种提供额外的保障。这类方法一般是通过体外挤出精子或研磨精巢获取新鲜的精子,用适量的冻存液混匀后,分装保存在液氮罐中。需要时可以随时通过体外授精的方法使精子复苏。经过30年的发展,随着冷冻保护剂的不断改良和冻存与复苏条件的不断优化,斑马鱼精子冻存与复苏技术已逐渐成熟。文章简单回顾了斑马鱼精子冻存与复苏技术的历史与发展,并重点介绍本实验室自2005年以来常规使用的斑马鱼精子冻存与复苏的方法及具体流程。

关键词：斑马鱼精子冻存精子复苏体外授精

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中心体复制及调控机制研究进展

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中国细胞生物学学报 2012年第12期34卷 1187-1196页

作者：何润生滕俊琳陈建国北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室北京100871

中心体是动物细胞内最主要的微管组织中心。此外,它还参与纺锤体组装、纤毛发生和细胞迁移等一系列生物过程。中心体异常不仅与肿瘤的发生密切相关,并且还会导致一些发育方面的疾病。该文总结了中心体的结构、复制过程及其调控机制等方... 详细信息

中心体是动物细胞内最主要的微管组织中心。此外,它还参与纺锤体组装、纤毛发生和细胞迁移等一系列生物过程。中心体异常不仅与肿瘤的发生密切相关,并且还会导致一些发育方面的疾病。该文总结了中心体的结构、复制过程及其调控机制等方面的研究进展,并讨论了中心体异常与肿瘤发生及发育相关疾病的关系,为更深入了解产生中心体异常的原因及一些相关疾病的诊断和治疗提供参考。

关键词：中心体中心粒复制中心粒周围物质肿瘤

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利用密码子优化的Cas9在斑马鱼基因组中实现高效基因突变

利用密码子优化的Cas9在斑马鱼基因组中实现高效基因突变

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第三届全国斑马鱼研究大会

作者：刘达王展翔肖安张雨田李文渊祖尧姚少华林硕张博北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室北京 100871 北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室北京 100871 美国加州大学洛杉矶分校分子、细胞与发育生物学系 CA90095-1606 美国加州大学洛杉矶分校分子、细胞与发育生物学系 CA90095-1606 北京大学深圳研究生院化学生物学与生物技术学院美国加州大学洛杉矶分校分子、细胞与发育生物学系 CA90095-1606

有规律间隔的短回文重复序列簇及其相关系统(CRISPR/Cas)是广泛存在于古细菌和真细菌中的一种消除外源DNA 的防御系统。最近,人们优化了这一体系,利用Cas9 蛋白与向导RNA(guide RNA,gRNA)构成一个简单的CRISPR/Cas 系统,在人类细胞、小... 详细信息

有规律间隔的短回文重复序列簇及其相关系统(CRISPR/Cas)是广泛存在于古细菌和真细菌中的一种消除外源DNA 的防御系统。最近,人们优化了这一体系,利用Cas9 蛋白与向导RNA(guide RNA,gRNA)构成一个简单的CRISPR/Cas 系统,在人类细胞、小鼠、斑马鱼、果蝇等多种生物体内成功地实现了基因打靶。其中,Cas9 蛋白作为核酸酶切割双链DNA,而gRNA 则通过碱基互补配对决定靶序列的特异性。然而,这一技术在斑马鱼中基因打靶的效率还有待提高,并且对斑马鱼基因组的脱靶效应也缺乏分析。在本研究中,我们根据斑马鱼的密码子偏好性优化了Cas9 的编码序列(称为zCas9),并与之前报道的人源化的Cas9(humanized Cas9,hCas9)的效率进行了比较。结果显示,在所检测的全部11个位点中,zCas9 的效率均高于hCas9,提高的幅度从4％到39％不等。其中,效率较低的位点差异更为明显,效率至少可提高一倍,甚至将无活性的位点转变为有活性的位点。靶向rpl11(ribosome protein L11)基因的位点是一个高活性位点,zCas9 与相应的gRNA 共注射后,斑马鱼胚胎出现跟注射反义寡核苷酸类似物morpholino(MO)类似的表型,这进一步证明了zCas9 对该位点的高诱变活性。同时,我们选择了另一个效率较高的位点CNT05 分析了zCas9 在斑马鱼中的脱靶效应。为此我们首先编写了一个程序用来预测潜在的脱靶位点,然后通过PCR 扩增结合深度测序分析脱靶情况。结果显示,在全部21 个可检测的潜在脱靶位点中,zCas9 注射组的突变率跟对照相比均没有显著差异。以上结果表明,zCas9 能够在斑马鱼中介导高效、高特异性的基因组定点突变。

关键词： CRISPR/Cas zCas9 斑马鱼基因打靶脱靶效应

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应用双荧光报告系统检测斑马鱼microRNA的动态表达

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遗传 2012年第9期34卷 1181-1192页

作者：杨红波梁巍刘新星朱作言林硕张博北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室北京100871 美国加州大学洛杉矶分校分子、细胞与发育生物学系洛杉矶900951606

microRNA(miRNA)是一类细胞内源表达的小分子非编码RNA,主要通过降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻译,在动植物的发育以及其他重要的生理过程中起调控作用。miRNA的功能跟它的表达位置与时间密切相关,但是目前尚缺乏一个能够在活体与... 详细信息

microRNA(miRNA)是一类细胞内源表达的小分子非编码RNA,主要通过降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻译,在动植物的发育以及其他重要的生理过程中起调控作用。miRNA的功能跟它的表达位置与时间密切相关,但是目前尚缺乏一个能够在活体与个体水平稳定、持续地实时观察miRNA动态表达的方法。文章以斑马鱼为模式,建立了一个双荧光报告系统(我们称之为miRNA Tracer),用于在斑马鱼整体胚胎中追踪特定miRNA的表达谱及动态变化过程。该系统以Tol2转座子为基础,采用来自斑马鱼hsp70基因的热激启动子分别驱动eGFP和mRFP1荧光报告基因,同时在其中一个报告基因的3′-UTR区连接待测miRNA的互补序列,构成Tracer质粒。该互补序列与斑马鱼胚胎中相应的内源miRNA结合后能够使对应报告基因的荧光信号强度减弱,通过比较两个报告基因在表达谱上的差异辨别miRNA的表达区域,检测斑马鱼胚胎中miRNA起作用的位置和时间。文章选择在肌肉系统特异表达的miR-206以及在神经系统特异表达的miR-219,分别在显微注射瞬时表达和转基因稳定整合等两个层次上验证了上述Tracer系统。结果表明,所用的方法能够如实地在单细胞水平和整体水平检测到目标miRNA的时空表达动态变化。miRNA Tracer系统为在斑马鱼发育过程中对miRNA进行活体、实时的时空定位提供了一个独特而有效的方法,也为对miRNA进行功能与作用机制等更深入的研究奠定了基础。

关键词：斑马鱼 miRNA 双荧光报告载体/Tracer 热激启动子

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