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首届曲霉与曲霉病新进展高峰论坛

作者：孙毅刘伟陈伟万喆李若瑜 100034北京北京大学第一医院皮肤性病科北京大学真菌和真菌病研究中心

目的研究唑类药物交叉耐药的烟曲霉临床分离株及其相关的耐药机制。方法自一例侵袭性曲霉病患者体内分离得到的一株烟曲霉，利用美国临床实验室标准化研究所(CLSI) M38-A2中的微量液基稀释法和E-test法测定该株烟曲霉对伊曲康唑(ITC)...

目的研究唑类药物交叉耐药的烟曲霉临床分离株及其相关的耐药机制。方法自一例侵袭性曲霉病患者体内分离得到的一株烟曲霉，利用美国临床实验室标准化研究所(CLSI) M38-A2中的微量液基稀释法和E-test法测定该株烟曲霉对伊曲康唑(ITC)、伏立康唑(VRC)、两性霉素B(AMB)、卡泊芬净(CAS)和泊沙康唑(POS)的药物敏感性;并对其唑类药物靶基因cyp51A进行克隆和测序分析。

关键词：

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我国重要病原性真菌的耐药性研究现状

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微生物与感染 2017年第1期12卷 2-7页

作者：刘伟北京大学第一医院皮肤性病科北京大学真菌和真菌病研究中心皮肤病分子诊断北京市重点实验室北京100034

近年来,病原性真菌的耐药现象越来越多,呈逐年上升趋势,且所致侵袭性感染已成为目前临床上患者死亡的重要原因之一。本文就我国在耐药性真菌的判断、流行病学、耐药机制及其防治等方面的研究现状进行简单介绍。

关键词：病原性真菌耐药性机制

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肝移植后播散性隐球菌病1例及其实验研究

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中国真菌学杂志 2008年第5期3卷 268-271页

作者：赵作涛纪黎明王爱平王晓阳陈伟万哲王晓红武玲慎李若瑜北京大学第一医院皮肤性病科北京大学真菌和真菌病研究中心北京100034 天津市第一中心医院皮肤科天津300192

目的播散性隐球菌病临床及实验研究。方法患者女,47岁,肝移植术后2 d,面部、肩部、四肢皮肤出现多发溃疡,伴昏迷。通过脑计算机断层扫描、皮损组织病理检查、PAS染色、皮损组织真菌培养及激光俘获显微切割结合PCR扩增序列分析确诊,并对... 详细信息

目的播散性隐球菌病临床及实验研究。方法患者女,47岁,肝移植术后2 d,面部、肩部、四肢皮肤出现多发溃疡,伴昏迷。通过脑计算机断层扫描、皮损组织病理检查、PAS染色、皮损组织真菌培养及激光俘获显微切割结合PCR扩增序列分析确诊,并对获得菌株进行尿素酶试验、API试验、PCR扩增测序等实验研究。结果皮损组织病理可见大量圆形和椭圆形菌体,PAS染色阳性。血液和脑脊液真菌镜检均为阴性。皮损组织真菌培养可见酵母样菌落生长,菌株尿素酶试验阳性,API试验鉴定为新生隐球菌。ITS区序列分析鉴定为新生隐球菌grub ii变种。激光俘获显微切割结合PCR扩增,序列分析与培养获得的菌株直接PCR扩增后序列分析结果一致。脑脊液特异性隐球菌抗原(++),血液特异性隐球菌抗原(++++)。脑CT显示为多发结节灶。依据临床及实验室检查确诊为播散性隐球菌病,致病菌为新生隐球菌grubii变种。结论通过对该病例的深入研究,为临床明确诊断播散性隐球菌病奠定基础,确立了显微切割技术在皮肤真菌感染中的应用价值。

关键词：播散性隐球菌病肝移植显微切割技术

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Real-time PCR在侵袭性曲霉病中的诊断价值

Real-time PCR在侵袭性曲霉病中的诊断价值

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第二届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学三江论坛

作者：余进高露娟孙毅万喆李若瑜北京大学第一医院皮肤性病科真菌和真菌病研究中心

目的:探讨real-time PCR在侵袭性曲霉病(IA)高危患者中的诊断价值,并与血清半乳甘露聚糖(GM)试验进行比较。方法回顾性调查分析2008年5月至2010年12月临床疑患IA住院患者1 10人次,根据诊断标准将确诊IA和临床诊断IA归为感染组,共22例,拟... 详细信息

目的:探讨real-time PCR在侵袭性曲霉病(IA)高危患者中的诊断价值,并与血清半乳甘露聚糖(GM)试验进行比较。方法回顾性调查分析2008年5月至2010年12月临床疑患IA住院患者1 10人次,根据诊断标准将确诊IA和临床诊断IA归为感染组,共22例,拟诊IA和非IA归为非感染组,共88例。对其住院期间的257份血清进行real-time PCR和GM检测,绘制real-time PCR的受试者操作曲线(ROC),计算ROC曲线下面积,制定最佳临界值;计算单次PCR阳性在不同分级诊断中的阳性率;计算不同PCR和/或GM诊断条件下的灵敏度(Se)、特异度(Sp)、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)等。采用McNemar配对检验对不同方法进行比较。结果ROC曲线下面积为0.91(95%CI:0.825～0.995),最佳临界循环值为39.45。单次PCR阳性对确诊和临床诊断的诊断率分别为100%和84.2%。不同诊断条件下Se、Sp、PPV和NPV存在差异。单次、两次PCR阳性Sp分别较单次、两次GM阳性显著升高(P<0.05),而Se无统计学差异;两次PCR阳性与单次PCR阳性相比Sp显著升高(P<0.05);结论 Real-time PCR对侵袭性曲霉病具有较高的诊断价值,其灵敏度和特异度均优于GM试验;两次PCR阳诊断侵袭性曲霉病能够提高诊断的特异度和阳性预测值。

关键词：侵袭性曲霉病特异度 PPV NPV 阳性预测值 Real-time PCR

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烟曲霉Afyap1基因功能研究

烟曲霉Afyap1基因功能研究

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2009全国中西医结合皮肤性病学术会议

作者：乔建军马彦万喆李若瑜刘伟北京大学第一医院皮肤科北京大学真菌和真菌病研究中心浙江大学医学院附属第一医院皮肤科

目的:利用根癌农杆菌介导的烟曲霉基因敲除技术对烟曲霉Afyap1基因进行敲除,并探讨其在抵抗氧化杀伤及侵袭性曲霉病发生中的作用。方法:用pyrG作为筛选标记、根癌农杆菌介导的方法敲除烟曲霉Afyap1基因。Afyap1基因敲除株命名为△Afyap... 详细信息

目的:利用根癌农杆菌介导的烟曲霉基因敲除技术对烟曲霉Afyap1基因进行敲除,并探讨其在抵抗氧化杀伤及侵袭性曲霉病发生中的作用。方法:用pyrG作为筛选标记、根癌农杆菌介导的方法敲除烟曲霉Afyap1基因。Afyap1基因敲除株命名为△Afyap1。再将Afyap1回补到△Afyap1得到菌株Re-△Afyap1。将能在烟曲霉内自主复制的含Afyap1基因的质粒、空白对照质粒转入烟曲霉,分别得到菌株MC、E。斑点法比较野生株（WT）、△Afyap1、Re-△Afyap1、E、MC对氧化剂的敏感性;显微镜下观察各菌株的产孢情况。比较WT、△Afyap1、Re-△Afyap1、E、MC对侵袭性肺曲霉病小鼠致病性的差异。结果: Afyap1转化子的同源重组率为43.8%（7/16）。Afyap1基因敲除株烟曲霉△Afyap1对HO及甲萘醌的敏感性比野生株高。MC对3种氧化剂——HO、甲萘醌以及二酰胺杀伤的抵抗能力比E强,这表明增加Afyap1基因在烟曲霉内的拷贝数能增强其抵抗氧化杀伤的能力。WT、△Afyap1、Re-△Afyap1、MC对免疫缺陷小鼠的致病性无明显差异。结论:①与以前的烟曲霉基因敲除方法相比,以pyrG为筛选标记、根癌农杆菌介导的烟曲霉基因敲除方法简便有效。②虽然在体外Afyap1基因参与烟曲霉抵抗氧化杀伤,但它不影响烟曲霉的致病性。

关键词：烟曲霉基因敲除氧化剂 Afyap1 基因功能研究

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实时荧光定量PCR方法诊断马尔尼菲青霉病方法的建立

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广西医科大学学报 2014年第3期31卷 515-516页

作者：莫冬冬曹存巍余进广西医科大学第一附属医院皮肤科南宁530021 北京大学第一医院皮肤科/真菌和真菌病研究中心北京100034

目的：建立马尔尼菲青霉病血清实时荧光定量PCR诊断方法,对马尔尼菲青霉DNA行绝对定量.方法：针对马尔尼菲青霉内转录间隔区设计特异引物和Taqman探针,对马尔尼菲青霉、16种常见致病真菌、2种常见致病细菌和人基因组DNA行实时荧光定量PC... 详细信息

目的：建立马尔尼菲青霉病血清实时荧光定量PCR诊断方法,对马尔尼菲青霉DNA行绝对定量.方法：针对马尔尼菲青霉内转录间隔区设计特异引物和Taqman探针,对马尔尼菲青霉、16种常见致病真菌、2种常见致病细菌和人基因组DNA行实时荧光定量PCR扩增,检测其特异性;以10倍浓度梯度的重组质粒为标准品,检测其敏感性.结果：该PCR方法特异度达100％;该方法最低检测限介于5～10 copies之间.结论：实时荧光定量PCR方法有助于早期、特异地诊断马尔尼菲青霉病.

关键词：马尔尼菲青霉病实时荧光定量PCR 诊断

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两株希木龙假丝酵母14α-去甲基化酶基因(ERG11)的克隆及其功能初步验证

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微生物与感染 2017年第2期12卷 89-93页

作者：张浩王千刘伟北京大学第一医院皮肤性病科北京大学真菌和真菌病研究中心皮肤病分子诊断北京市重点实验室北京100034

为探讨希木龙假丝酵母(假丝酵母又称念珠菌)的耐药机制,首先克隆出两株希木龙念珠菌ERG11基因,初步验证其功能,从而为后续研究奠定基础。从美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)基因数据库中... 详细信息

为探讨希木龙假丝酵母(假丝酵母又称念珠菌)的耐药机制,首先克隆出两株希木龙念珠菌ERG11基因,初步验证其功能,从而为后续研究奠定基础。从美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)基因数据库中获取白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌Erg11蛋白的保守序列,设计简并引物,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获得希木龙念珠菌ERG11cDNA部分片段;用快速cDNA末端扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)分别扩增其5′和3′端,获得完整的ERG11编码序列(coding sequence,CDS);将CDS克隆到pYES2表达载体中,在尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母中过表达ERG11;用微量液基稀释法检测转化后的酿酒酵母对氟康唑的敏感性,初步验证其功能。结果显示,简并PCR扩增获得预期708bp片段,5′RACE和3′RACE分别获得385bp和1 336bp片段,经纯化、克隆、测序、比对分析,获得两株菌的ERG11CDS;比对其编码的蛋白,与其他念珠菌的Erg11蛋白高度同源;分别检测克隆了这两株希木龙念珠菌ERG11CDS表达载体的酿酒酵母对氟康唑的敏感性,发现过表达ERG11明显降低其对氟康唑的敏感性。结果提示,简并PCR联合RACE能准确有效地克隆出希木龙念珠菌ERG11基因,用pYES2酿酒酵母表达系统能初步验证其功能。

关键词：希木龙假丝酵母简并聚合酶链反应快速cDNA末端扩增法

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基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在皮肤癣菌鉴定中的应用

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在皮肤癣菌鉴定中的应用

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多彩菌物美丽中国——中国菌物学会2019年学术年会

作者：邵锦万喆李若瑜余进北京大学第一医院皮肤科皮肤病分子诊断北京市重点实验室北京大学真菌和真菌病研究中心

【目的】基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是近年来新兴的病原菌鉴定技术。本研究目的是评价MALDI-TOF MS鉴定皮肤癣菌的应用价值。【方法】使用MALDI-TOF MS及布鲁克丝状真菌库v1.0鉴定北京大学真菌和真菌病研究中心保藏的54株皮肤癣菌,鉴定结果与真菌内转录间隔区(internal transcribed spacers, ITS)序列鉴定结果进行比较,评价该数据库对皮肤癣菌的鉴定情况。选取另外27株皮肤癣菌(包括趾间毛癣菌、须癣毛癣菌、许兰毛癣菌、紫色毛癣菌、疣状毛癣菌、本海姆毛癣菌、犬小孢子菌、石膏小孢子菌和絮状表皮癣菌)作为参考菌株构建了PKU数据库,联合该数据库和布鲁克丝状真菌库v1.0再次鉴定54株皮肤癣菌。【结果】使用MALDI-TOF MS及布鲁克丝状真菌库v1.0鉴定54株皮肤癣菌,27(50.0%)株被正确鉴定到种水平,34株(63.0%)被正确鉴定到属水平,15株(27.8%)被鉴定错误。联合PKU数据库和布鲁克丝状真菌库v1.0进行鉴定,43株(79.6%)被正确鉴定到种水平,49株(90.7%)被正确鉴定到属水平。【结论】仅采用布鲁克丝状真菌库v1.0,MALDI-TOF MS对皮肤癣菌的鉴定性能不高,仅对红色毛癣菌鉴定性能较好,对本海姆毛癣菌和石膏小孢子菌的鉴定效果尚可,对趾间毛癣菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌的鉴定效果较差。补充构建数据库后,MALDI-TOF MS能够准确地鉴定临床常见的皮肤癣菌。某些皮肤癣菌复合体菌株蛋白指纹谱图相似度较高,会部分影响MALDI-TOF MS对这些菌株的正确鉴定。补充数据库可以进一步提高鉴定效能。

关键词： MALDI-TOF MS 鉴定皮肤癣菌

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马尔尼菲青霉氧化应激反应相关基因SKN7的克隆及功能研究

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广西医科大学学报 2011年第1期28卷 38-41页

作者：袁锡华曹存巍刘伟李若瑜广西医科大学第一附属医院皮肤科南宁530021 北京大学第一医院真菌与真菌病研究中心

目的:克隆双相真菌马尔尼菲青霉(PM)的氧化应激反应相关基因SKN7,并通过对酵母SKN7缺陷株的互补试验证明该基因是氧化应激反应相关基因。方法:提取PM标准株DNA及RNA后,通过简并PCR结合RACE技术克隆PM的SKN7基因;实时荧光定量PCR(Real-ti... 详细信息

目的:克隆双相真菌马尔尼菲青霉(PM)的氧化应激反应相关基因SKN7,并通过对酵母SKN7缺陷株的互补试验证明该基因是氧化应激反应相关基因。方法:提取PM标准株DNA及RNA后,通过简并PCR结合RACE技术克隆PM的SKN7基因;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)比较该基因在25℃及37℃温度下的表达;将该基因的cDNA插入酵母表达载体pY-ES2.0,转化酿酒酵母SKN7基因缺陷株,比较互补后酿酒酵母SKN7基因缺陷株对H2O2的抵抗能力是否增强。结果:PM的SKN7基因全长约2.5 kb,开放读码框为1 776 bp,推测编码592个氨基酸;包含4个内含子5个外显子及两个高度保守的结构域。该基因在双相温度表达量无变化,互补试验证明转化PM的SKN7基因后酿酒酵母SKN7基因缺陷株重新具有抵抗H2O2杀伤的能力。结论:PM的SKN7基因是氧化应激反应相关基因,但并不是酵母相特异表达基因。

关键词：马尔尼菲青霉氧化应激反应 SKN7 克隆基因

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常见病原真菌的药物敏感性监测及耐药机制的研究

常见病原真菌的药物敏感性监测及耐药机制的研究

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2012年中国菌物学会学术年会

作者：刘伟孙毅谭静文刘伟霞陈伟万喆李若瑜北京大学第一医院皮肤科北京大学真菌和真菌病研究中心皮肤病分子诊断北京市重点实验室

我们在对自2008年7月到2011年11月间分离到的213株曲霉病原菌进行抗真菌药物敏感性监测的过程中,共得到烟曲霉130株,黄曲霉58株,土曲霉16株,其它9株;其中耐伊曲康唑的烟曲霉1株,对伏立康唑和伊曲康唑同时耐药者1株;耐伏立康唑的黄曲霉2...

我们在对自2008年7月到2011年11月间分离到的213株曲霉病原菌进行抗真菌药物敏感性监测的过程中,共得到烟曲霉130株,黄曲霉58株,土曲霉16株,其它9株;其中耐伊曲康唑的烟曲霉1株,对伏立康唑和伊曲康唑同时耐药者1株;耐伏立康唑的黄曲霉2株;未发现对棘白菌素类药物耐药的菌株;我们发现曲霉菌的耐药性具有如下特点:（1）耐药的曲霉种类在增多;（2）对新型唑类药物如伏立康唑耐药的烟曲霉菌株正在增多,且部分存在对伊曲康唑等药物的交叉耐药;（3）由耐药菌株混合所致的感染也在出现。研究耐药机制时发现:（1）烟曲霉中唑类药物作用靶酶编码基因特定位点的突变决定着交叉耐药和特异性耐药的发生,因此发展出了检测耐药菌株的现先进方法;（2）黄曲霉唑类药物作用靶酶基因的特定突变是导致耐药的机制;（3）曲霉形成生物膜后药物泵基因表达水平的过度增高是对抗真菌药物的敏感性明显降低的重要原因之一,而棘白菌素类药物与其他药物联合时对曲霉生物膜具有协同抗真菌作用。在对全国念珠菌血症患者的389株病原菌研究时发现,白念珠菌156株,近平滑念珠菌83株,热带念珠菌67株,光滑念珠菌50株,其它少见菌33株。对FLC耐药的菌株有23株,未发现对CAS耐药者。

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