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鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗与活疫苗体外介导鸡淋巴细胞NF-κB表达的调节通路研究

动物医学进展 2020年第6期41卷 42-46页

作者：叶丽娜李林沈佳张建伟史爱华郑小兰崔丽娜章振华北京市农林科学院畜牧兽医研究所/畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京100097

为研究鸡传染性法氏囊病(IBD)免疫复合物疫苗与活疫苗体外刺激对鸡淋巴细胞NF-κB表达的影响,以及IBD免疫复合物疫苗和活疫苗引起淋巴细胞NF-κB的表达是否与PKC通路、PTK通路、Ca2+通道的调节有关,以及对细胞内Ca2+浓度的影响,试验选... 详细信息

为研究鸡传染性法氏囊病(IBD)免疫复合物疫苗与活疫苗体外刺激对鸡淋巴细胞NF-κB表达的影响,以及IBD免疫复合物疫苗和活疫苗引起淋巴细胞NF-κB的表达是否与PKC通路、PTK通路、Ca2+通道的调节有关,以及对细胞内Ca2+浓度的影响,试验选取28日龄SPF鸡脾脏,分离脾脏淋巴细胞,分别用IBD免疫复合物疫苗和BX株活疫苗刺激,另外设立分别加入PKC抑制剂、PTK抑制剂、Ca2+抑制剂、NF-κB抑制剂的对照组,加LPS的阳性组,加PBS的空白组。体外分别培养21 h和45 h后,ELISA方法测定细胞培养上清中NF-κB浓度,激光共聚焦显微镜观察细胞内NF-κB核移位情况,流式细胞仪测定细胞内Ca2+浓度。结果表明,IBD免疫复合物疫苗和活疫苗体外刺激均能够引起NF-κB、Ca2+浓度升高,使NF-κB发生核移位,但免疫复合物疫苗引起细胞内Ca2+浓度的升高与对照组无显著性差异,活疫苗与对照组差异显著(P<0.05)。提示IBD免疫复合物疫苗和活疫苗体外刺激能够激活淋巴细胞内NF-κB,引起Ca2+浓度的升高,但两种疫苗引起NF-κB表达的上调与PKC、PTK通路无相关性,与Ca2+通道的调节有关。

关键词：鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗活疫苗淋巴细胞 NF-κB表达相关因素

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副鸡禽杆菌外膜囊泡的生物学活性分析

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中国兽医杂志 2020年第1期56卷 1-4,9页

作者：梅晨孙爱华李淑芳龚玉梅王宏俊北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京海淀100097

为研究副鸡禽杆菌(Apg)外膜囊泡(OMVs)的生物活性,提取了A型副鸡禽杆菌的外膜囊泡。纯化后的OMVs用透射电镜观察其形态结构;将OMVs加入到鸡巨噬细胞(HD-11)培养液中,检测一氧化氮(NO)产生量的变化;用荧光定量PCR(qPCR)检测HD-11各炎症... 详细信息

为研究副鸡禽杆菌(Apg)外膜囊泡(OMVs)的生物活性,提取了A型副鸡禽杆菌的外膜囊泡。纯化后的OMVs用透射电镜观察其形态结构;将OMVs加入到鸡巨噬细胞(HD-11)培养液中,检测一氧化氮(NO)产生量的变化;用荧光定量PCR(qPCR)检测HD-11各炎症相关因子的表达量变化情况;将OMVs经肌肉注射接种SPF鸡,检测鸡血清IgG抗体产生情况,并用3种血清型的副鸡禽杆菌强毒菌株攻击免疫鸡,测定其免疫保护率。结果显示,电镜下的副鸡禽杆菌OMVs呈球形,直径在20~300 nm;OMVs可极显著提高HD-11中NO产量;qPCR结果显示,OMVs作用可显著上调鸡巨噬细胞IL-2、IL-6、 IL-1β、IL-10、iNOs等炎症相关因子的表达。免疫鸡可以产生特异性的IgG抗体。用A型副鸡禽杆菌攻毒,免疫保护率为70%,对异种血清型交叉保护性较弱,仅有10%~30%。本研究为深入研究副鸡禽杆菌外膜囊泡的功能奠定了基础。

关键词：副鸡禽杆菌外膜囊泡活性分析

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鸡传染性囊病免疫复合物疫苗和活疫苗对鸡外周血淋巴细胞免疫功能的影响

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中国兽医杂志 2020年第10期56卷 42-45页

作者：叶丽娜李林沈佳张建伟史爱华郑小兰章振华北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京海淀100097

为比较鸡传染性囊病(IBD)免疫复合物疫苗和活疫苗免疫对鸡外周血免疫淋巴细胞功能的影响,本试验用IBD免疫复合物疫苗和BX株活疫苗免疫1日龄SPF鸡,并设立空白对照,于免疫后7、14、21、2835 d和42 d采用流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率及CD4... 详细信息

为比较鸡传染性囊病(IBD)免疫复合物疫苗和活疫苗免疫对鸡外周血免疫淋巴细胞功能的影响,本试验用IBD免疫复合物疫苗和BX株活疫苗免疫1日龄SPF鸡,并设立空白对照,于免疫后7、14、21、2835 d和42 d采用流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率及CD4^+T、CD8^+T、Bu-1^+B细胞数变化。结果显示,免疫后7 d,活疫苗组淋巴细胞凋亡率极显著高于免疫复合物疫苗组和对照组(P<0.01),其他时间3组均无显著性差异(P>0.05);与对照组相比,免疫复合物疫苗组免疫后7~42 d主要引起CD4^+T细胞数升高(P<0.05或P<0.01),活疫苗组主要引起CD8^+T细胞数升高(P<0.05或P<0.01),但均能导致Bu-1^+B细胞数减少(P<0.05或P<0.01)。表明本免疫复合物疫苗和活疫苗均能增强鸡外周血细胞免疫功能,但对体液免疫均有一定的抑制作用。本试验为IBD免疫复合物疫苗的研发提供了依据。

关键词： IBD免疫复合物疫苗活疫苗外周血免疫功能

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肠菌素结合载体疫苗降低空肠弯曲菌在鸡肠道定植的研究

肠菌素结合载体疫苗降低空肠弯曲菌在鸡肠道定植的研究

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中国微生物学会兽医微生物学专业委员会暨中国畜牧兽医学会生物制品学分会2021年学术论坛

作者：崔一芳郭芳芳曹晓亚杨兵周宏专苏霞徐福洲北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室

空肠弯曲菌是引起人细菌性肠炎的主要病原,是最重要的食源性病原微生物之一。该菌感染鸡不引起任何明显的临床症状,但在鸡肠道内长期定植,是人弯曲菌病的主要污染来源。肠菌素（enterobactin,Ent）是由肠杆菌科细菌分泌的一种小分子化合... 详细信息

空肠弯曲菌是引起人细菌性肠炎的主要病原,是最重要的食源性病原微生物之一。该菌感染鸡不引起任何明显的临床症状,但在鸡肠道内长期定植,是人弯曲菌病的主要污染来源。肠菌素（enterobactin,Ent）是由肠杆菌科细菌分泌的一种小分子化合物,对铁离子具有极高亲和力,在维持肠道细菌铁代谢平衡方面发挥关键作用;空肠弯曲菌自身不能分泌Ent,但可利用Ent介导的铁摄取系统,帮助其在肠道定植。基于此,本研究将小分子Ent与大分子载体蛋白匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）偶联,制备Ent-KLH结合载体蛋白疫苗,与佐剂乳化后免疫SPF雏鸡,通过三次独立的鸡免疫攻毒试验,评价了该结合载体疫苗的安全性、免疫效力、抗体持续期等不同指标。结果显示,在安全性评价方面,Ent-KLH疫苗免疫鸡三次后对鸡增重、主要免疫器官（肝脏、脾脏、法氏囊、胸腺）发育、肠道微生物菌群组成等均无显著影响;在免疫效力评价方面,Ent-KLH疫苗免疫鸡一次、二次或三次均可在鸡体内诱导高水平的Ent特异性血清抗体,免疫二次或三次后使用空肠弯曲菌NCTC 11168口服攻毒,可显著降低其在肠道定植3-4log单位;抗体持续期结果显示,经单次免疫后鸡血清Ent特异性抗体可持续分泌8周。本试验结果显示,研制的Ent-KLH结合载体蛋白疫苗免疫鸡具有良好的安全性,诱导产生的高水平Ent特异性抗体可显著降低空肠弯曲菌在鸡肠道内的定植水平,该载体疫苗的研制对降低鸡肠道食源性微生物定植水平、提高动物源性食品安全将具有重要意义和潜在应用价值。

关键词：肠菌素结合载体疫苗空肠弯曲菌肉鸡定植

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犬细小病毒感染F81细胞的microRNA表达谱差异分析

犬细小病毒感染F81细胞的microRNA表达谱差异分析

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中国微生物学会兽医微生物学专业委员会暨中国畜牧兽医学会生物制品学分会2021年学术论坛

作者：周宏专苏霞徐福洲林路路张进齐颀杨兵北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是犬科动物最常见的、危害最严重的致病因子之一。CPV病毒经过不断变异,最初的CPV-2型已分化为CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b和CPV-2c等5种亚型,所有亚型在我国均有报道。研究表明,MicroRNA... 详细信息

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是犬科动物最常见的、危害最严重的致病因子之一。CPV病毒经过不断变异,最初的CPV-2型已分化为CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b和CPV-2c等5种亚型,所有亚型在我国均有报道。研究表明,MicroRNA (miRNA)可通过与病毒核酸或宿主因子相互作用,调控病毒的复制。但CPV感染过程中,miRNA调控病毒复制的分子机制报道较少。为进一步阐明miRNA在CPV感染过程中的作用,本研究将研究室前期分离的New CPV-2a型SD6毒株感染F81细胞,利用高通量small RNA-seq(sRNA-seq)技术对CPV感染组和未感染组各3例细胞样本进行检测,获得两组F81细胞的miRNAs表达谱并进行差异分析。感染组与未感染组相比,上调的miRNAs有59个,下调的miRNAs有44个(|log2FC|>1且P<0.05为标准)。通过miRanda软件对差异表达的miRNAs靶基因进行预测,并对靶基因进行GO和KEGGPathways分析;结果显示,对应靶基因具有ATP、DNA和RNA结合功能,蛋白质激酶活性,以及锌和钙等金属离子结合功能,并参与转录调控、信号转导、细胞粘附、蛋白质磷酸化、信号转导和细胞分化等多种生物学过程。研究结果表明,CPV感染对F81细胞中miRNA表达水平影响显著,获得的miRNA表达谱数据为进一步研究CPV感染宿主的致病机制提供参考。

关键词：犬细小病毒 microRNA 差异表达

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共表达传染性法氏囊病病毒LX株VP2蛋白及鸡新城疫病毒PX02/3株F蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建

共表达传染性法氏囊病病毒LX株VP2蛋白及鸡新城疫病毒PX02/3株F蛋...

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中国微生物学会兽医微生物学专业委员会暨中国畜牧兽医学会生物制品学分会2021年学术论坛

作者：江波许健李永清北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京市农林科学院畜禽疫病研究中心

鸡新城疫(Newcastle disease,ND)、鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)和鸡马立克病(Marek's disease,MD)均为高度接触性传染病,因其高死亡率对家禽业的健康发展构成严重威胁。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的表面糖蛋白F蛋白和传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)的VP2蛋白存在多处抗原位点能诱导机体产生中和抗体,使机体产生保护性免疫应答,是开发亚单位疫苗的主要候选蛋白。火鸡疱疹病毒(Herpesvirus,HVT)是常规应用于预防马立克病的异源疫苗,其复制非必需区可容纳较大的外源基因片段的插入不会影响其自身的复制和生物学特性,是理想的活病毒载体。构建表达传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2基因和鸡新城疫病毒(NDV) F基因的重组火鸡疱疹病毒(HVT),进而开发一针三防的重组三联疫苗,在降低生产中疫苗使用成本的同时还可以极大限度的简化免程序。为此本研究利用基因重组技术,在HVT基因组的非必需区UL45-46插入CMV启动子调控下的IBDV LX株的VP2基因表达盒,然后在HVT基因组的非必需区US1-10插入pec启动子调控下的NDV PX02/3株的F基因表达盒,成功构建并拯救出同时表达IBDV和NDV保护性抗原基因的重组HVT病毒(rHVT-VP2-F)。分别以IBDVVP2基因和NDVF基因的特异性引物对重组病毒进行筛选和鉴定,采用抗HVT鸡血清对重组病毒进行空斑染色和计数,以测定重组HVT的病毒滴度。IBDVVP2和NDVF基因能否在重组病毒感染的CEF中表达并获得抗原性蛋白,对其免疫后是否产生保护力至关重要,将rHVT-VP2-F第3代细胞毒感染的CEF进行Western Blot和IFA鉴定,结果显示VP2和F蛋白获得表达。本研究构建的重组病毒,为研究rHVT-VP2-F三联活载体疫苗提供候选病毒株奠定了基础。

关键词：新城疫病毒传染性法氏囊病病毒重组火鸡疱疹病毒 F基因 VP2基因

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共表达鸡传染性法氏囊病病毒LX株VP2基因及鸡新城疫病毒PX02/3株F基因的重组火鸡疱疹病毒的构建

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中国兽医杂志 2020年第11期56卷 26-30,I0004,I0005页

作者：王子书王萍许健杨大为李永清江波江西农业大学动物科学技术学院江西南昌330045 北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京海淀100097 北京市农林科学院畜禽疫病研究中心北京海淀100097

为构建表达传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP 2基因和鸡新城疫病毒(NDV)F基因的重组火鸡疱疹病毒(HVT)。本研究利用基因重组技术,在HVT基因组的非必需区UL45-46插入CMV启动子调控下的IBDV LX株的VP 2基因表达盒,然后在HVT基因组的非必需区US1... 详细信息

为构建表达传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP 2基因和鸡新城疫病毒(NDV)F基因的重组火鸡疱疹病毒(HVT)。本研究利用基因重组技术,在HVT基因组的非必需区UL45-46插入CMV启动子调控下的IBDV LX株的VP 2基因表达盒,然后在HVT基因组的非必需区US1-10插入pec启动子调控下的NDV PX02/3株的F基因表达盒,成功构建并拯救出同时表达IBDV和NDV保护性抗原基因的重组HVT病毒(rHVT-VP2-F)。经PCR、Western Blot、IFA鉴定,重组病毒能稳定表达具有生物学活性的VP2蛋白和F蛋白。本研究为研制rHVT-VP2-F活载体疫苗提供了科学依据。

关键词：新城疫病毒传染性法氏囊病病毒重组火鸡疱疹病毒 F基因 VP 2基因

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鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中的分泌表达及免疫原性分析

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中国兽医杂志 2020年第12期56卷 14-17,23,I0002页

作者：洪家兵王萍王晓玥于非可刘文晓李永清江西农业大学动物科学技术学院江西南昌330045 北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京海淀100097 北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室北京昌平102206

根据杆状病毒表达系统的密码子偏好性,对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP 2基因序列进行密码子优化,然后合成序列。优化后的序列被定向克隆至转移载体pFast Bac^(TM)1,转化DH10Bac^(TM)感受态细胞获取重组杆状病毒穿梭质粒,转染昆虫细胞SF9... 详细信息

根据杆状病毒表达系统的密码子偏好性,对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP 2基因序列进行密码子优化,然后合成序列。优化后的序列被定向克隆至转移载体pFast Bac^(TM)1,转化DH10Bac^(TM)感受态细胞获取重组杆状病毒穿梭质粒,转染昆虫细胞SF9,获得P0代重组杆状病毒。间接免疫荧光鉴定和Western blot分析结果显示,病毒reBac-VP2感染昆虫细胞后,能够在昆虫细胞的上清中稳定表达VP2蛋白,而且能够与IBDV的抗体发生特异性结合,具有良好的免疫原性。本试验成功构建了能够分泌表达VP2蛋白的重组杆状病毒,为IBDV诊断试剂及亚单位疫苗研发提供了工具。

关键词：鸡传染性法氏囊病病毒杆状病毒蜂毒肽 VP2蛋白

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犬细小病毒研究进展

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动物医学进展 2019年第12期40卷 79-84页

作者：周宏专苏霞徐福洲杨兵北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是犬急性胃肠炎的主要致病因子之一,典型的临床症状包括呕吐、发热和腹泻,通常6周龄~6月龄的幼犬更易感染。20世纪70年代后期出现CPV-2后目前已在世界范围内流行。病原学研究显示CPV基因组替代率与RN... 详细信息

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是犬急性胃肠炎的主要致病因子之一,典型的临床症状包括呕吐、发热和腹泻,通常6周龄~6月龄的幼犬更易感染。20世纪70年代后期出现CPV-2后目前已在世界范围内流行。病原学研究显示CPV基因组替代率与RNA病毒相似,基因组中多个位点出现了新的变异,与病毒致病机制密切相关,引起了科研人员的广泛关注。在检测方面目前开展了多重聚合酶链反应(multiple PCR),聚合酶链式扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS-PCR),隔热式恒温PCR(insulated isothermal PCR,iiPCR),高分辨率熔解曲线PCR(high-resolution melting PCR,PCR-HRM),横向流动试纸条技术(immunocapture-loop mediated isothermal amplification-lateral flow dipstick,IC-LAMP-LFD),聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR),重组聚合酶扩增方法(recombinase polymerise amplification,RPA),Luminex液态悬浮芯片系统(Luminex xTAG)和免疫层析(immunochromatography,IC)等方法,在防控方面开展了核酸疫苗、重组亚单位苗、病毒样颗粒等新型疫苗以及治疗性药物研究。论文对CPV的流行病学、病原学、检测方法及防控措施等进行了综述。

关键词：犬细小病毒流行病学致病机理检测方法疫苗

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5种常见犬腹泻病毒基因芯片检测方法的建立

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中国畜牧兽医 2019年第8期46卷 2211-2219页

作者：苏霞周宏专常彦嫣齐颀林路路张进徐福洲杨兵北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室

为建立一种简便、快速、高效的可同时区分犬腺病毒1型(canine adenovirus type 1,CAV-1)、犬腺病毒2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)、犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)、犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)、犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)5种常见犬腹泻病毒的基因芯片诊断方法,本研究以CAV-1、CAV-2、CCV、CDV、CPV 5种犬腹泻病毒为靶病毒,根据NCBI上收录的病毒基因序列在其保守区域内设计引物,在此基础上根据变异区域设计针对每种病毒的探针2~3条,优化检测体系的各反应条件,确定该检测方法的特异性与敏感性,建立可同时区分5种病毒的基因芯片检测方法。结果显示,建立的基因芯片检测方法可同时检测以上述5种犬腹泻病毒,其中PCR的退火温度为55℃、延伸时间为1 min 15 s;探针与PCR产物的杂交温度40℃、杂交时间2.5 h时,该方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒标准品的检测限分别为0.2 fg/μL、2 fg/μL、2 fg/μL、20 pg/μL和0.02 fg/μL,具有较高的灵敏性;同时对犬副流感病毒进行特异性试验,发现无阳性信号出现,具有较强的特异性;对14份临床腹泻样品检测结果显示,基因芯片方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒的阳性检出率分别为28.57%、50.00%、64.28%、14.28%和85.71%,并且基因芯片检测方法的敏感性较PCR要高10~100倍。以上结果表明,本研究建立的基因芯片检测方法具有特异、敏感等特点,对临床中犬类混合感染病毒检测具有一定的诊断意义。

关键词：犬腹泻病毒基因芯片诊断

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