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结核病与胸部肿瘤 2021年第4期 316-321页

作者：李悄王伟李传友首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所耐药结核病研究北京市重点实验室细菌免疫室北京101149

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的重大传染性疾病,据统计2019年全球约1000万结核病新增病例,而且这一数字近年来保持相对稳定,与艾滋病、疟疾并列为世界三大疾病[1-2]。卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,B... 详细信息

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的重大传染性疾病,据统计2019年全球约1000万结核病新增病例,而且这一数字近年来保持相对稳定,与艾滋病、疟疾并列为世界三大疾病[1-2]。卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)是1921年由法国科学家Calmette和Guerin发明的牛型结核分枝杆菌减毒活疫苗。

关键词：减毒活疫苗 tuberculosis 卡介苗结核病牛型结核分枝杆菌新增病例艾滋病

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PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统对MTB DNA检测方法的初步研究

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中国防痨杂志 2020年第12期42卷 1280-1288页

作者：于佳佳张旭霞张雨晴任卫聪姚丛李传友刘毅唐神结北京市结核病胸部肿瘤研究所首都医科大学附属北京胸科医院耐药结核病研究北京市重点实验室细菌免疫室101149 北京市结核病胸部肿瘤研究所首都医科大学附属北京胸科医院结核病多学科诊疗中心101149

目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法将MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-1crRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果选择相对荧光强度值最大的IS6110-1crRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为101拷贝/μl的质粒和100拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于106拷贝/μl的MTB DNA质粒的相对荧光强度值[89204.07(66253.60,108819.13)](Z值均=-9.448,P值均<0.001),显示特异度良好。结论首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术,具有敏感度及特异度高、稳定性好、成本低等特点,有望进一步用于临床样本的检测。

关键词：结核,分枝杆菌聚合酶链反应 DNA探针微阵列分析 CRISPR-Cas13a

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扩增子测序技术检测石蜡包埋组织标本耐药结核基因的研究

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中华结核和呼吸杂志 2020年第3期43卷 234-241页

作者：宋婧张治国董宇杰杜伟丽王宇轩刘子臣李琨张倩孙倩车南颖首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所病理科/耐药结核病研究北京市重点实验室 101149 北京市昌平区结核病防治所 102200

目的用基于多重PCR (multiplex PCR,mPCR)扩增子的二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术(mPCR-NGS)检测MTB的耐药基因突变,并评估其检测石蜡包埋组织标本诊断耐药结核病的临床应用价值.方法选取北京市昌平区结核病防治所2013... 详细信息

目的用基于多重PCR (multiplex PCR,mPCR)扩增子的二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术(mPCR-NGS)检测MTB的耐药基因突变,并评估其检测石蜡包埋组织标本诊断耐药结核病的临床应用价值.方法选取北京市昌平区结核病防治所2013年4月至2015年10月常规进行了利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星和氧氟沙星比例法检测且具有药敏试验结果的50株MTB临床分离株,包括42株耐药MTB和8株敏感MTB菌株.参考耐药基因数据库及相关文献,针对以上8种抗结核药物主要耐药基因及常见位点设计耐药基因组合,建立有效的检测方案.收集首都医科大学附属北京胸科医院病理科2017年11月至2018年9月耐药结核病患者55例的石蜡包埋组织标本,探针熔解曲线法检测结果为利福平、异烟肼、乙胺丁醇和氟喹诺酮类至少存在一种耐药相关基因突变.首先对已知表型药敏试验结果的MTB临床分离株进行mPCR-NGS检测,验证该方法检测纯菌样本的有效性,再进一步检测结核病患者石蜡包埋组织标本进行临床验证.主要评价指标为敏感度和特异度以及一致性.结果以比例法为金标准,mPCR-NGS检测利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇的敏感度分别为95% (38/40)、93%(27/29)、93% (27/29)和72%(13/18),特异度分别为100%(10/10)、95% (20/21)、100%(21/21)和94%(30/32);二线注射类药物卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星敏感度均为100% (2/2,3/3,3/3),特异度分别为98%(47/48)、100%(33/33)和100%(47/47);氧氟沙星的敏感度为70%(7/10),特异度为100%(40/40).总符合率为94%,一致性检验Kappa值为0.87.纳入的55例石蜡包埋组织标本经探针熔解曲线法检测,28例利福平耐药,37例异烟肼耐药,13例乙胺丁醇耐药,17例氟喹诺酮类耐药.mPCR-NGS与探针熔解曲线法比较,利福平、异烟肼、乙胺丁醇和氟喹诺酮类的敏感度分别为100%(28/28)、95%(35/37)、100%(13/13)和100%(17/17);特异度均为100%(27/27,18/18,42/42,38/38).两种方法总符合率为99%,一致性检验Kappa值为0.98.结论 mPCR-NGS检测MTB临床分离株及结核病患者石蜡包埋组织标本耐药基因突变的敏感度、特异度和符合率较高,有望成为耐药结核病准确、快速的分子病理诊断新技术.

关键词：分枝杆菌结核石蜡包埋组织抗药性基因测定

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PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统对MTB DNA检测方法的初步研究

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结核病与胸部肿瘤 2021年第1期 6-14页

目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法将MTB保守序列IS6110片段插入pMD^(TM)19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-lcrRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果选择相对荧光强度值最大的IS6110-lcrRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为10^(1)拷贝/μl的质粒和10^(0)拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于10^(6)拷贝/μl的MTE DNA质粒的相对荧光强度值[89204.07(66253.60,108819.13)](Z值均9.448,P值均<0.001),显示特异度良好。结论首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术,具有敏感度及特异度高、稳定性好、成本低等特点,有望进一步用于临床样本的检测。

关键词：结核,分枝杆菌聚合酶链反应 DNA探针微阵列分析 CRISPR-Cas13a

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结核分枝杆菌γ-干扰素释放试验及临床应用专家意见(2021年版)

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中华结核和呼吸杂志 2022年第2期45卷 143-150页

作者：中华医学会结核病学分会陈心春李亮申阿东杨倩婷余方友汪峰张文宏逄宇高孟秋高磊不详广东省区域免疫与疾病重点实验室深圳大学基础医学院病原生物学系深圳518052 北京市结核病胸部肿瘤研究所首都医科大学附属北京胸科医院北京101149 首都医科大学附属北京儿童医院深圳市第三人民医院同济大学附属上海市肺科医院华中科技大学同济医学院附属同济医院复旦大学附属华山医院首都医科大学附属北京胸科医院中国医学科学院病原生物学研究所

γ-干扰素释放试验(IGRA)是世界卫生组织推荐的用于诊断结核分枝杆菌感染的体外免疫学方法,也是我国肺结核诊断标准中用于活动性结核辅助诊断的手段之一。近年,IGRA的方法和技术不断发展和更新,在国内的临床应用中也积累了丰富的经验。... 详细信息

γ-干扰素释放试验(IGRA)是世界卫生组织推荐的用于诊断结核分枝杆菌感染的体外免疫学方法,也是我国肺结核诊断标准中用于活动性结核辅助诊断的手段之一。近年,IGRA的方法和技术不断发展和更新,在国内的临床应用中也积累了丰富的经验。本专家意见在中华医学会结核病学分会2014年编写的《γ-干扰素释放试验在中国应用的建议》基础上,根据最新发展和临床经验进行修订和完善,从原理和技术进展、质量控制、结核潜伏感染诊断的应用、活动性肺结核辅助诊断应用、特殊人群中的应用以及常见药物对IGRA结果的影响六个部分提出专家意见,以期为IGRA在中国的临床应用提供指导。

关键词：活动性肺结核活动性结核中华医学会肺结核诊断结核病学辅助诊断免疫学方法结核分枝杆菌

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结核性脑膜炎实验室诊断现状与展望

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中国防痨杂志 2020年第5期42卷 442-448页

作者：李自慧张宗德首都医科大学附属北京胸科医院北京市结核病胸部肿瘤研究所耐药结核病研究北京市重点实验室101149

结核性脑膜炎是一种最严重和常见的中枢神经系统结核病,快速确诊和及时治疗是改善患者预后和提高患者生存率的关键。但是,由于缺乏有效的检测手段,确诊结核性脑膜炎目前仍非常困难。作者针对结核性脑膜炎实验室诊断的现状、最新研究进展... 详细信息

结核性脑膜炎是一种最严重和常见的中枢神经系统结核病,快速确诊和及时治疗是改善患者预后和提高患者生存率的关键。但是,由于缺乏有效的检测手段,确诊结核性脑膜炎目前仍非常困难。作者针对结核性脑膜炎实验室诊断的现状、最新研究进展,以及所面临的问题和挑战进行论述和讨论,呼吁进一步通过合作加强结核性脑膜炎的实验室诊断研究。

关键词：结核,脑膜实验室技术和方法早期诊断基于问题的学习研究进展

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新型结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测技术对结核病辅助诊断的价值评估

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结核病与胸部肿瘤 2021年第4期 245-250页

作者：潘丽萍高孟秋贾红彦黄麦玲魏荣荣孙琦邢爱英杜博平张宗德首都医科大学附属北京胸科医院耐药结核病研究北京市重点实验室北京市结核病胸部肿瘤研究所 110149

目的评价以干扰素诱导蛋白-10(IP-10)为靶标的新型结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测技术,即结核感染T细胞检测(PCR荧光探针法,简称***)在结核病辅助诊断中的性能,及该检测技术与结核感染T细胞斑点检测(***)技术的一致性。方法2018年... 详细信息

目的评价以干扰素诱导蛋白-10(IP-10)为靶标的新型结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测技术,即结核感染T细胞检测(PCR荧光探针法,简称***)在结核病辅助诊断中的性能,及该检测技术与结核感染T细胞斑点检测(***)技术的一致性。方法2018年3月至2019年11月,在首都医科大学附属北京胸科医院前瞻性纳入疑似结核病患者,并募集结核分枝杆菌低感染风险人群。所有入组者同时行外周血***检测和***检测,受试者操作特征曲线计算两种检测技术的诊断价值,两种检测技术的一致性分析采用kappa检验,IP-10相对表达量和释放γ干扰素的斑点形成细胞数量的相关性分析采用Pearson检验。结果纳入结核病患者235例、非结核病患者110例、结核分枝杆菌低感染风险人群153例进行最终分析。***检测(3/498,0.60%)和***检测(6/498,1.21%)获得的不确定结果比例差异无统计学意义(P=0.32)。在489例有效检测标本中,***检测的敏感度和特异度分别为91.3%(95%CI 86.8%〜94.6%)和81.1%(95%CI 75.8%〜85.7%),其中结核分枝杆菌低感染风险人群中的诊断特异度为98.0%(95%CI 94.4%〜99.6%);***检测的敏感度和特异度分别为93.0%(95%C788.9%〜96.0%)和83.8%(95%CI 78.7%〜88.1%),其中结核分枝杆菌低感染风险人群中的诊断特异度为100%(95%CI97.6%〜100.0%)。两种检测技术的诊断敏感度和特异度差异均无统计学意义(P>0.05)。两种检测技术的阳性符合率为91.0%(95%CI 87.5%〜94.5%),阴性符合率为88.9%(95%CI 84.9%〜92.9%),总符合率为90.0%(95%CI 87.3%〜92.6%),一致性检验kappa值为0.80(95%CI 0.75〜0.85,P<0.001)。结论***检测具有与***检测一致的诊断性能,可用于结核病辅助诊断。

关键词：结核分枝杆菌,结核干扰素诱导蛋白-10 γ-干扰素释放试验

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长链非编码RNA MALAT1在肿瘤诊治中的研究进展

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实用医学杂志 2021年第16期37卷 2164-2167页

作者：李悄李国政张博王伟首都医科大学附属北京胸科医院北京市结核病胸部肿瘤研究所耐药结核病研究北京市重点实验室细菌免疫室北京101149 安徽医科大学生命科学学院遗传学教研室合肥230032 安徽医科大学第二附属医院肿瘤科合肥230601

长链非编码RNA(long non⁃coding RNA,lncRNAs)是一种长度大于200 nt且不具备编码潜能的转录本,因其异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关而成为当前的研究热点。MALAT1作为最早发现的lncRNA之一,可通过不同途径参与调控肿瘤细胞的增殖、... 详细信息

长链非编码RNA(long non⁃coding RNA,lncRNAs)是一种长度大于200 nt且不具备编码潜能的转录本,因其异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关而成为当前的研究热点。MALAT1作为最早发现的lncRNA之一,可通过不同途径参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭以及转移等,影响肿瘤的发展进程。本文即针对MALAT1在多种肿瘤中的研究现状做一综述,为今后肿瘤的诊断和治疗提供新思路。

关键词： MALAT1 lncRNA 肿瘤诊断治疗靶点

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外周血单核细胞相关指标联合***辅助诊断涂阴肺结核的临床价值探讨

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国际呼吸杂志 2021年第24期41卷 1841-1847页

作者：吕霞丽林婷婷高静韬贾红彦李自慧舒薇潘丽萍张宗德李琦北京市结核病胸部肿瘤研究所首都医科大学附属北京胸科医院耐药结核病研究北京市重点实验室101149

目的观察涂阴肺结核患者外周血单核细胞和淋巴细胞的表达特点,探讨其与结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验(***)联合检测在涂阴肺结核诊断与鉴别诊断中的临床价值,为其早期诊断提供新指标。方法以2018年1月1日至2018年12月31日在首都医科大... 详细信息

目的观察涂阴肺结核患者外周血单核细胞和淋巴细胞的表达特点,探讨其与结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验(***)联合检测在涂阴肺结核诊断与鉴别诊断中的临床价值,为其早期诊断提供新指标。方法以2018年1月1日至2018年12月31日在首都医科大学附属北京胸科医院住院的134例涂阴肺结核患者、56例肺癌患者和95例肺炎患者作为研究对象,收集并回顾性分析3组患者外周血单核细胞、淋巴细胞、单核细胞与淋巴细胞(ML)比值、***及相关临床资料。选择在3组患者间差异有统计学意义的指标,采用敏感度、特异度、误诊率、漏诊率和诊断正确率,评估其单独或联合***在涂阴肺结核与肺癌、肺炎诊断与鉴别诊断中的临床价值。结果(1)涂阴肺结核组单核细胞百分比[(8.96±2.46)%]、ML绝对值比值(0.36±0.19)均高于肺癌组[分别为(7.06±1.34)%、0.30±0.13]和肺炎组[分别为(8.17±2.13)%、0.31±0.18],而其白细胞总数[(5.86±1.75)×10^(9)/L]低于肺癌组[(6.88±1.76)×10^(9)/L],淋巴细胞绝对值[(1.57±0.54)×10^(9)/L]低于肺炎组[(1.87±0.67)×10^(9)/L],差异均有统计学意义(P值均<0.05)。(2)就涂阴肺结核与肺癌鉴别诊断而言,单核细胞百分比的特异度(87.50%)较高,误诊率(12.50%)较低,优于ML绝对值比值(分别为17.86%、82.14%)和***(67.86%、32.14%)。ML绝对值比值的敏感度(88.81%)与***(87.31%)相接近。就涂阴肺结核与肺炎鉴别诊断而言,ML绝对值比值的敏感度(88.81%)高于单核细胞百分比(66.42%),与***(87.31%)相接近,但其特异度(28.42%)低于***(63.16%)和单核细胞百分比(56.84%)。(3)单核细胞百分比和ML绝对值比值分别联合***(并联)辅助诊断涂阴肺结核的的敏感度分别为97.01%和99.25%,漏诊率分别为2.99%和0.75%。在涂阴肺结核与肺癌的鉴别诊断中,单核细胞百分比联合***(串联)的特异度为94.64%,误诊率为5.36%。在涂阴肺结核和肺炎鉴别诊断中,单核细胞百分比联合***(串联)和ML绝对值比值联合***(串联)的特异度分别为82.11%和70.53%,误诊率分别为17.89%和29.47%。结论单核细胞百分比和ML绝对值比值与***联合检测分别在涂阴肺结核与肺癌、肺炎的鉴别诊断中具有潜在的临床价值,且其测定简便易行、价格低廉,可以作为涂阴肺结核辅助诊断指标,根据临床需要选择。

关键词：涂阴肺结核单核细胞/淋巴细胞比值诊断价值误诊率

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中华诊断学电子杂志 2021年第1期9卷 62-66页

作者：于佳佳张旭霞李传友刘毅唐神结首都医科大学附属北京胸科医院北京市结核病胸部肿瘤研究所耐药结核病研究北京市重点实验室细菌免疫室101149 首都医科大学附属北京胸科医院北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病多学科诊疗中心101149

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)与相关蛋白Cas(CRISPR-Cas)系统是近来的研究热点,除在基因编辑方面有重要作用外,其应用于感染性疾病诊断方面也有很好的发展前景。传统感染性疾病检测及分子检测诊断技术在操作、检测周期及敏感度... 详细信息

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)与相关蛋白Cas(CRISPR-Cas)系统是近来的研究热点,除在基因编辑方面有重要作用外,其应用于感染性疾病诊断方面也有很好的发展前景。传统感染性疾病检测及分子检测诊断技术在操作、检测周期及敏感度、特异度等方面存在不足。随着对CRISPR-Cas系统的深入研究,针对其特异核酸的识别和遗传修饰功能,可开展对感染性病原体检测技术的应用,目前发现可应用于检测的主要有Cas9、Cas12a和Cas13核酸酶。利用该检测技术的高效性、特异性和可编程性,可开展对寨卡病毒、登革热病毒、疟疾菌株、结核分枝杆菌、人乳头瘤病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒及严重急性呼吸综合征冠状病毒2等一系列感染性疾病病原体的检测。CRISPR-Cas基因编辑技术可能成为一种快速、灵敏、特异、低廉和可靠的诊断技术,为感染性疾病的诊断提供重要的理论依据。笔者主要对Cas9、Cas12a、Cas13等在感染性疾病诊断中的应用及其进展进行综述。

关键词：规律成簇间隔短回文重复序列 Cas蛋白传染病病原体基因编辑

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