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第九届中国林业青年学术年会

作者：雷杨林善枝郑会全刘文凤安新民张志毅北京林业大学林木育种国家工程实验室林木花卉遗传育种教育部重点实验室

病程相关蛋白（Pathogenesis related proteins,PRs/PRP）是植物在发病或病理相关环境下诱导产生并积累的一类蛋白质的总称,它们组成了植物抗病免疫反应的一道重要防线。杨树作为木本模式植物,其抗病研究一直是林木抗逆性育种研究热点... 详细信息

病程相关蛋白（Pathogenesis related proteins,PRs/PRP）是植物在发病或病理相关环境下诱导产生并积累的一类蛋白质的总称,它们组成了植物抗病免疫反应的一道重要防线。杨树作为木本模式植物,其抗病研究一直是林木抗逆性育种研究热点。毛白杨（Populus tomentosa Carr.）是我国特有的白杨派乡土树种,具有分布广、速生、抗逆性强、材质优良等特性,克隆获得毛白杨病程相关蛋白基因并对其结构与功能以及表达模式进行分析显然具有重要的理论意义与应用价值。因此,本研究以毛白杨为试材,首先分离获得了3个编码病程相关蛋白,分别命名为PtPR-1、PtPR-5与PtPR-10。其中,PtPR-1基因（GenBank Accession ***589199）具有一个大小为486-bp的开放阅读框,编码了一个含有161个氨基酸的前体蛋白,该蛋白含有3个α螺旋以及4个β折叠结构;而PtPR-5基因（GenBank Accession ***589200）包含的开放阅读框大小为678-bp,编码了一个225氨基酸前体蛋白序列。生物信息学分析结果表明,PtPR-5蛋白具有17个卷曲和6个β折叠亚结构。另外,PtPR-10基因（GenBank Accesion ***589201）开放阅读框为483-bp,编码了一个160氨基酸的蛋白,蛋白主体结构为7个β折叠,2个α螺旋以及1个二硫键。为分析PtPR-1、PtPR-5与PtPR-10基因的诱导表达特性及其时间模式,本研究首先对毛白杨植株分别进行SA与MeJA诱导处理,并提取叶片组织总RNA,同时采用qRT-PCR定量分析了PR-1、PR-5和PR-10基因的表达以及在SA与MeJA诱导处理0-48h的表达模式。结果表明,在SA诱导下,PR-1表达水平先是缓慢增长,而后迅速升高约200倍:PR-5的表达呈先高后低再正常的波动特点;而PR-10表达量呈先升高后缓慢递减趋势。而MeJA处理下,PR-1表达量表现为升高-下降-升高的特点:PR-5的表达先下调后恢复正常:在MeJA诱导下,PR-10表达水平不断升高,这与PR-1受SA诱导表达模式相似。这些结果说明,病程相关蛋白PtPR-1、PtPR-5和PtPR-10对SA和MeJA信号途径均有响应,暗示了病程相关蛋白作为防卫反应效应基因,与抗病信号通路密不可分。上述研究结果为进一步分析毛白杨病程相关蛋白的功能及毛白杨抗病改良提供了重要基础。

关键词：毛白杨病程相关蛋白基因诱导处理 qRT-PCR

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RNAi技术沉默PtDrl01基因对毛白杨病程相关蛋白基因表达的影响

RNAi技术沉默PtDrl01基因对毛白杨病程相关蛋白基因表达的影响

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第九届中国林业青年学术年会

作者：刘文凤张谦郑会全雷杨林善枝安新民张志毅北京林业大学林木育种国家工程实验室林木花卉遗传育种教育部重点实验室

抗病(R)基因是植物抗病免疫系统中的关键组成部分,该类基因编码蛋白通常包含了保守的功能结构域如核苷酸结合位点(Nucleotide binding site,NBS)和富含亮氨酸重复(Ieucine rich repeat,LRR)序列,因此也统称为NBS-LRR R蛋白。NBS-LRR R... 详细信息

抗病(R)基因是植物抗病免疫系统中的关键组成部分,该类基因编码蛋白通常包含了保守的功能结构域如核苷酸结合位点(Nucleotide binding site,NBS)和富含亮氨酸重复(Ieucine rich repeat,LRR)序列,因此也统称为NBS-LRR R蛋白。NBS-LRR R蛋白编码基因占据了约全部抗病基因数目的75%,组成了抗病基因中的最大家族,而这些抗病基因的作用对象也几乎囊括了所有的病原物包括病毒、细菌、真菌、线虫甚至昆虫等,对该类基因的表达及其在植物抗病免疫调控系统中的作用进行研究具有重要意义。杨树是木本植物的模式植物,其抗病性研究一直是林木抗逆性研究的热点;而毛白杨(Populus tomentosa Cart)是我国特有的白杨派(Section Leuce)乡土树种,具有分布广、速生、材质优良及抗逆性强等特点,对毛白杨NBS-LRR类抗病基因的表达及其功能进行研究显然具有重要的理论意义与应用价值。本实验室前期已从三倍体毛白杨[(***×***)×***]抗病无性系中首先分离获得一个NBS-LRR类抗病基因序列(编码了一个NLS-TIR-NBS-LRR蛋白)即PtDrl01(GenBank Accession ***157840),并证明该基因在转化烟草中具有抗烟草花叶病毒能力。为进一步分析PtDrl01基因的抗病免疫调控功能,本研究首次构建了PtDrl0l基因的RNAi载体pBI121-PtDr101-RNAi,进而采用基因枪法将pBl121-PtDr101-RNAi质粒转化到毛白杨叶片,并诱导获得抗卡那霉素候选转化芽,经生根诱导最终获得系列候选转化植株。以卡那霉素抗性植株基因组总DNA为模板,对CaMV 35S启动子及NP7II基因作双序列PCR鉴定,共筛选获得5个转基因无性系。在此基础上,运用qRT-PCR技术对转化植株PtDrl01基因的表达作定量分析发现,RNAi序列在转基因毛白杨中对PtDrl01基因的表达抑制率均高于50%;其中,值得注意的是,转基因无性系Z3 PtDrl01基因表达抑制率达到了100%,这表明RNAi序列在转基因毛白杨中能够对PtDrl01基因的表达起有效的抑制甚至沉默的作用。对沉默了PtDrl01基因表达的Z3植株,本研究利用qRT-PCR技术定量分析了毛白杨病程相关蛋白基因(PtPR-1、PtPR-5和PtPR-10)的表达,结果发现检测的病程相关蛋白基因其表达均明显低于对照非转化植株,而其中PtPR-10的表达量在转化植株中甚至减少为7倍以上。这说明,PtDrl01基因的表达在毛白杨中影响了病程相关蛋白基因的表达水平,而这也暗示了PtDrl01基因可能通过调控病程相关蛋白基因的表达水平,进而提高植株抗病反应能力。上述研究结果为进一步分析毛白杨PtDrl01基因的表达及功能提供了重要基础。

关键词：毛白杨 PtDrl01基因 RNAi技术 qRT-PCR

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白杨杂交胚胎挽救及子代遗传变异分析

白杨杂交胚胎挽救及子代遗传变异分析

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第九届中国林业青年学术年会

作者：马开峰张志毅赵曦阳江锡兵薄文浩宋跃朋北京林业大学林木育种国家工程实验室林木花卉遗传育种教育部重点实验室

林木杂交育种是创新林木种质、获取目的性状（如提高生长量、改良木材质量、增强抗逆性等）以及研究林木进化等理论的重要方法和手段。白杨派（Leuce Duby）树种在我国分布广泛,其中毛白杨、河北杨、响叶杨等为我国特有树种。在我国白... 详细信息

林木杂交育种是创新林木种质、获取目的性状（如提高生长量、改良木材质量、增强抗逆性等）以及研究林木进化等理论的重要方法和手段。白杨派（Leuce Duby）树种在我国分布广泛,其中毛白杨、河北杨、响叶杨等为我国特有树种。在我国白杨杂交育种工作中,学者们利用丰富的种质资源广泛开展了种内、种间杂交试验,选育出很多优良品种。但同时人们发现,白杨派某些种杂交不亲和、幼胚败育严重,人工杂交困难,获得杂种子代效率较低,甚至不能获得杂交子代。随着组织培养技术的发展,采用胚胎挽救技术可阻止杂交幼胚的败育从而获得子代,目前已在柿树杂交育种、葡萄三倍体育种、花卉杂交育种等方面发挥了一定的作用。

关键词：白杨胚胎挽救发芽率成苗率

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杨树花发育关键基因的RNAi、DNM载体转化毛白杨的研究

杨树花发育关键基因的RNAi、DNM载体转化毛白杨的研究

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第九届中国林业青年学术年会

作者：曹冠琳安新民于来薄文浩王静澄张志毅北京林业大学林木育种国家工程实验室林木花卉遗传育种教育部重点实验室

毛白杨（Populus tomentosa Carr.）是优良的绿化和用材树种,但是毛白杨雌株花期产生大量飞絮,给生产生活带来诸多不便。LFY是花分生组织特征基因,控制花启动,毛果杨PTLF（***）在花序中表达量最高;AP1既为花分生组织特征基因,同时又控... 详细信息

毛白杨（Populus tomentosa Carr.）是优良的绿化和用材树种,但是毛白杨雌株花期产生大量飞絮,给生产生活带来诸多不便。LFY是花分生组织特征基因,控制花启动,毛果杨PTLF（***）在花序中表达量最高;AP1既为花分生组织特征基因,同时又控制花萼和花瓣的发育,PTAP1在美洲山杨（***）花发育初期的形成层中开始表达,并在以后的发育过程中继续表达;PTAG1/2基因为花器官特异性基因,它们在毛果杨雄蕊和心皮内表达。为抑制毛白杨开花,解决飞絮污染环境的问题,本研究利用农杆菌介导的叶盘转化法将这些杨树花发育关键基因的RNAi载体PTAG-IR、PTAP1-IR、PTAP1:PTAG-IR、PTLF:PTAG-IR,以及dominant negative mutation（DNM）载体En35S::AP1-M2::E9s转化毛白杨雌性无性系TC1521。经PCR检测,转基因毛白杨阳性株系数目分别为PTAG-IR5株,PTAP1-IR 4株,PTAP1:PTAG-IR6株,PTLF:PTAG-IR 7株,En35S::AP1-M2::E9 7株。转基因毛白杨移栽后的苗期观察发现,PTAG-IR,PTAP1:PTAG-IR,PTLF:PTAG-IR的转基因株系高度低于野生型对照,而PTAP1-IR转基因毛白杨高度与野生型接近。

关键词：毛白杨花发育基因 RNAi DNM

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毛白杨不同倍性花粉DNA的荧光观察及定量分折

毛白杨不同倍性花粉DNA的荧光观察及定量分折

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第九届中国林业青年学术年会

作者：曹媛张志毅荆艳萍北京林业大学林木育种国家工程实验室林木花卉遗传育种教育部重点实验室

毛白杨（Populus tomentosa Carr.）是我国特有的白杨派重要的绿化和用材乡土树种。研究发现,二倍体毛白杨中存在天然2n花粉以及由于减数分裂异常或染色体异常而产生的非整倍数败育花粉。这种现象一方面与天然三倍体毛白杨的形成联系紧... 详细信息

毛白杨（Populus tomentosa Carr.）是我国特有的白杨派重要的绿化和用材乡土树种。研究发现,二倍体毛白杨中存在天然2n花粉以及由于减数分裂异常或染色体异常而产生的非整倍数败育花粉。这种现象一方面与天然三倍体毛白杨的形成联系紧密,另一方面影响毛白杨的育种工作的效率。花粉核DNA不仅是花粉倍性的指标物质,而且对整个花粉正常发育过程起着核心作用。正常成熟花粉通过不均等有丝分裂形成一个较大的营养细胞和一个较小的生殖细胞,然后生殖细胞进行一次均等有丝分裂形成两个生殖核。在花粉管萌发和伸长过程中,营养细胞率先移入花粉管向花粉管尖端方向移动,两个生殖核紧随其后,最终经由花粉管尖端排出。我们利用激光共聚焦荧光显微镜,在大量实验基础上克服荧光标记不易量化的困难,建立了相对稳定的DNA荧光相对定量经验分析体系。实验采用DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）对毛白杨小孢子及其体外萌发过程进行DNA荧光标记,统一花粉培养条件、染色条件（1ug/ml DAPI,5min）和制片细节,统一成片到上机观察前的存放条件和时间（-20℃C,1天）,统一激光共聚焦显微镜的可调节参数及条件（60x油镜,405nm激发光,ND40,固定扫描步距、增益值、扣除背景等）。将扫描得到的图片进行3D重构,再用闭合曲线勾画蓝色荧光的范围,得到范围内荧光量的各种参数值,最后分析统计得出相对荧光量（精确面积×平均荧光光强）。初步结果显示,我们所采用的无性系LM50中,2n花粉占花粉总量的比例约5-10%。自然单倍、2n花粉及不同大小的败育花粉其核DNA量的统计值与其直径大小在正常范围内成比例。同时,有发现个别花粉大小偏离正常值,但核DNA定量分析结果仍显示其为单倍性。异常的花粉通常呈现干瘪、皱缩、多核,或者体积极小无核,其DNA定量结果明显偏离平均值。在花粉体外萌发实验中,2n花粉占正常萌发花粉的比例更小。但在正常萌发的花粉中,单倍花粉的生殖核荧光总量与2n花粉的生殖核荧光总量统计值比接近1:2,两个生殖核荧光量统计值比接近1:1。此外,毛白杨单倍和2n花粉的营养细胞核及其胞质中均有一定量的荧光标记,并且强度与生殖核相比较弱,但营养细胞总的荧光量高于生殖细胞,胞质荧光背景较强且呈点状不均匀分布,而这些点状物是否全部为携带细胞质遗传物质的细胞器则有待进一步实验验证。以上结果暗示,进一步研究不同品种毛白杨的天然单倍性花粉、天然2n花粉与人工加倍2n花粉的胞质DNA具体分布并对其进行定量分析,可以为毛白杨三倍体育种工作和毛白杨细胞质遗传的机制提供理论依据。

关键词：激光共聚焦 2n花粉细胞质DNA 三倍体育种

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高温处理诱导杨树大孢子染色体加倍选育三倍体技术研究

高温处理诱导杨树大孢子染色体加倍选育三倍体技术研究

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第九届中国林业青年学术年会

作者：王君索玉静康向阳北京林业大学林木育种国家工程实验室林木花卉遗传育种教育部重点开放实验室

多倍体育种是杨树遗传改良的重要途径,特别是利用2n配子的有性多倍化技术,由于综合利用了倍性优势和杂合优势,展现了巨大的发展潜力。国内外有关杨树倍性育种的实践证明,杨树三倍体在生长、抗性和材质等方面均表现优良,一些品种已在林... 详细信息

多倍体育种是杨树遗传改良的重要途径,特别是利用2n配子的有性多倍化技术,由于综合利用了倍性优势和杂合优势,展现了巨大的发展潜力。国内外有关杨树倍性育种的实践证明,杨树三倍体在生长、抗性和材质等方面均表现优良,一些品种已在林业生产中广泛应用,取得了巨大的经济效益。该研究以青杨派杂种‘哲引3号杨为材料,在掌握其大孢子发生进程及其即时判别技术的基础上,对施加高温处理诱导其大孢子染色体加倍的技术条件进行了探索,为选育适宜我国"三北"地区困难立地生长的青杨派多倍体品种奠定基础。

关键词：杨树三倍体 2n大孢子高温处理

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银杏小孢子蛋白提取及双向电泳技术优化

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西南林学院学报 2010年第3期30卷 45-49页

作者：王亚茹李云孙宇涵王谦北京林业大学林木育种国家工程实验室林木花卉遗传育种教育部重点实验室国家林业局树木花卉育种与生物工程重点开放实验室生物科学与技术学院北京100083 北京林业大学总务与产业管理处环境科北京100083

对银杏小孢子蛋白提取方法、上样量等进行试验。结果表明:在蛋白提取方面,TCA/丙酮法最佳,该方法提取的总蛋白得率最高,所获蛋白在2-DE图谱获得的点数最多、最清晰;饱和酚法次之;Tris-HCl法最差。上样量方面,蛋白上样量为1 500μg时得到... 详细信息

对银杏小孢子蛋白提取方法、上样量等进行试验。结果表明:在蛋白提取方面,TCA/丙酮法最佳,该方法提取的总蛋白得率最高,所获蛋白在2-DE图谱获得的点数最多、最清晰;饱和酚法次之;Tris-HCl法最差。上样量方面,蛋白上样量为1 500μg时得到的2-DE图片,蛋白点清晰,重叠现象少,图谱质量最佳;蛋白上样量为2 100μg时2-DE图谱的多蛋白点相互重叠,横竖条纹严重;上样蛋白为900μg时,2-DE图谱上蛋白点较少,丰度较弱。

关键词：银杏双向电泳蛋白提取上样量

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基于ESTs序列的杨树木质部形成相关EST-SSRs标记的开发与应用

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分子植物育种 2010年第5期8卷 963-970页

作者：宋跃朋江锡兵张曼李博王泽亮薄文浩安新民张志毅北京林业大学林木育种国家工程实验室林木花卉遗传育种教育部重点实验室国家林业局树木花卉育种与生物工程重点开放实验室北京100083 西北农林科技大学园艺学院杨凌712100

ESTs数据库的发展为分子标记的开发提供了宝贵的资源。本研究从NCBI下载与杨树木质部形成相关的5359条ESTs序列,在其中257条序列中检测到279个SSRs位点,检出率为5.2%。全部SSRs共分为84种重复单元,平均长度18.2bp,变幅为15～36bp,平均... 详细信息

ESTs数据库的发展为分子标记的开发提供了宝贵的资源。本研究从NCBI下载与杨树木质部形成相关的5359条ESTs序列,在其中257条序列中检测到279个SSRs位点,检出率为5.2%。全部SSRs共分为84种重复单元,平均长度18.2bp,变幅为15～36bp,平均分布频率1/6.94kb。所有类型中三核苷酸重复单元占总SSRs的41.3%,处于主导地位。AAG占三核苷酸重复单元的比例为27.0%,是三核苷酸重复单元中的优势重复类型。利用primer3在线设计引物,通过生物信息学方法筛选出7对引物,其中6对扩增效果较好。利用筛选出的引物对19个杨树无性系进行扩增,每对引物产生多态性条带数目为3～6条,平均4.16条。引物多态信息量变化范围为0.2267～0.9845,平均0.5485。应用NTSYS软件在相似系数为0.68水平可将19个杨树无性系准确聚类。研究结果表明,利用ESTs序列进行SSRs的开发是一种切实有效的方法,为EST-SSRs在杨树遗传图谱构建以及遗传多样性等方面的应用奠定了基础。

关键词：杨树木质部形成 EST-SSRs 聚类分析

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四倍体刺槐硬枝沙藏结合生长调节物质处理扦插研究

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黑龙江农业科学 2010年第8期 85-88页

作者：孟丙南彭祚登张中林徐慧敏李云北京林业大学林木育种国家工程实验室/林木花卉遗传育种教育部重点实验室/国家林业局树木花卉育种与生物工程重点开放实验室北京100083 北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室北京100083 河南省洛宁县林业局河南洛宁471700

为了解决四倍体刺槐硬枝扦插成活率低的问题,利用冬季沙藏结合生长调节物质处理和倒放催根的方法对四倍体刺槐进行硬枝扦插试验。结果表明:经冬季沙藏,结合沙藏前和扦插时的2次生长调节物质处理,插穗扦插成活率最高,达66.67%;在IBA、NAA... 详细信息

为了解决四倍体刺槐硬枝扦插成活率低的问题,利用冬季沙藏结合生长调节物质处理和倒放催根的方法对四倍体刺槐进行硬枝扦插试验。结果表明:经冬季沙藏,结合沙藏前和扦插时的2次生长调节物质处理,插穗扦插成活率最高,达66.67%;在IBA、NAA和ABT三种生长调节剂的处理试验中,500 ***-1的ABT处理插穗扦插成活率最好,成活率达71.11%;插穗倒放沙藏明显提高了扦插成活率;插穗经温室沙藏处理比室外沙藏处理成活率高。

关键词：四倍体刺槐硬枝扦插植物生长调节剂

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美洲黑杨与大青杨杂种无性系苗期光合特性研究

美洲黑杨与大青杨杂种无性系苗期光合特性研究

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第九届中国林业青年学术年会

作者：江锡兵李博张志毅马开峰何占国刘承友北京林业大学林木育种国家工程实验室林木花卉遗传育种教育部重点实验室河北省平泉县林业局

对杨树光合特性的研究一直是杨树遗传改良的一个重要方面。为探讨美洲黑杨与大青杨杂种无性系苗期的光合特性和规律,以美洲黑杨与大青杨杂交所得3个生长及抗性等表现优良的杂种无性系1年生盆栽扦插苗为材料,采用Li一6400光合测定系统对... 详细信息

对杨树光合特性的研究一直是杨树遗传改良的一个重要方面。为探讨美洲黑杨与大青杨杂种无性系苗期的光合特性和规律,以美洲黑杨与大青杨杂交所得3个生长及抗性等表现优良的杂种无性系1年生盆栽扦插苗为材料,采用Li一6400光合测定系统对3个无性系的光合作用指标进行测定。结果表明:在7月中旬,天气晴朗条件下,3个无性系的净光合速率和蒸腾速率日变化均呈不对称的双峰曲线,气孔导度和胞间C02浓度日变化分别呈单峰和倒双峰变化趋势:编号为191的无性系净光合速率日变化曲线两次峰值均高于165和177,191和177的低值高于165:3个无性系的净光合速率一光响应曲线相近,净光合速率均随着光合有效辐射的增加而增大,接近光饱和点时上升趋势平缓:191的光饱和点高于165和177,而光补偿点低于165和177,表明191适应光强的能力强于165和]77。

关键词：美洲黑杨大青杨杂种光合作用

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