目的:应用基因芯片生物信息学分析思路筛查大肠癌细胞相关基因Nrf3,构建融合蛋白真核表达载体,检测其对体外转染癌细胞周期与凋亡的影响。方法:实验于2004-01/2006-07在南方医科大学病理解剖教研室及肿瘤研究所与中国农业大学农业生物技术国家重点实验室完成。①实验材料:大肠癌细胞组织及其配对的正常大肠黏膜各3例,由解放军总医院病理科提供;大肠癌LoVo细胞系由南方医科大学肿瘤研究所提供;肝癌SMMC7721细胞系由解放军军事医学科学院放射医学研究所提供;真核表达载体pEGFP-N1(Clontech公司)。②实验方法:分别应用Excel表、Affymetrix Microarray Suite Software 5.0分析软件和STATA7.0分析软件,对基因芯片表达谱数据行交集补集分析、秩和检验及T检验,筛选"最重要的大肠癌细胞差异表达基因&ESTs",差异表达P<0.05,差异倍数>2。应用文献轮廓法进一步分析确定首选研究基因为Nrf3,提取组织样品总RNA,cDNA合成,PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化,插入T载体中,SalⅠ和BamHⅠ双酶切后连接到pEGFP-N1载体,获得重组pEGFP-N1-Nrf3质粒。LoVo细胞在体外加入含体积分数为0.1小牛血清、100u/mL青链霉素的RPMI-1640培养基,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中,待转染质粒pEGFP-N1-Nrf3与阴性对照质粒pEGFP-N1转染36h后,荧光显微镜观察候选基因亚细胞定位,FCM分选术观察其在体外对LoVo细胞周期和凋亡的影响。同法观察重组pEGFP-N1-Nrf3质粒体外转染对SMMC7721细胞周期和凋亡的影响。结果:①首选研究大肠癌细胞相关基因的确认:多种统计学方法分析获得最重要的大肠癌细胞相关基因17个,文献轮廓法进一步确认Nrf3为首选研究基因。②Nrf3基因表达:RT-PCR法检测Nrf3在3例大肠癌细胞组织均有表达,而在与其相配对的正常黏膜中表达较弱或不表达,与芯片检测结果基本一致;Nrf3在LoVo细胞中有表达。③Nrf3亚细胞定位:重组pEGFP-N1-Nrf3质粒转染的LoVo细胞其绿色荧光主要分布于细胞核内,提示Nrf3可能定位于细胞核内。④Nrf3在体外对癌细胞周期与凋亡的影响:体外培养36h后与未转染LoVo细胞的空白对照比较,重组pEGFP-N1-Nrf3质粒转染的LoVo细胞S+G2/M期所占比例明显减低,G2/M期下降尤为显著,G0/G1期细胞所占比例明显增加。Nrf3转染作用于LoVo细胞后,未观察到明显"亚G1"峰(即凋亡峰)的出现。Nrf3体外转染的SMMC7721细胞周期及凋亡情况与LoVo细胞基本相似。结论:大肠癌细胞相关基因Nrf3在体外能够抑制LoVo细胞、SMMC7721细胞的DNA合成和有丝分裂,促使癌细胞阻滞于G0/G1期,抑制其生长增殖的同时不影响细胞凋亡,可作为大肠癌细胞候选分子标志物。
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