检索结果-内蒙古大学图书馆

中华实验和临床病毒学杂志 2010年第2期24卷 125-127页

作者：刘晓燕石峰赵鸿王慧芬解放军第三0二医院肝衰竭治疗研究中心北京100039 解放军第三0二医院传染病研究所北京100039

目的探讨乙型肝炎病毒所致慢加急性肝衰竭（HBV—ACLF）患者外周血中CD8^＋T细胞上PD-1（Programmed death-1）的表达以及对CD8^＋T细胞的影响。方法收集60例HBV—ACLF患者外周血；应用流式细胞仪检测外周血中CD8^＋淋巴细胞上的PD-1、C... 详细信息

目的探讨乙型肝炎病毒所致慢加急性肝衰竭（HBV—ACLF）患者外周血中CD8^＋T细胞上PD-1（Programmed death-1）的表达以及对CD8^＋T细胞的影响。方法收集60例HBV—ACLF患者外周血；应用流式细胞仪检测外周血中CD8^＋淋巴细胞上的PD-1、CD95、穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B、CD107a的表达以及CD14细胞上PD—L1的表达；根据不同病情分期和不同预后比较各分子的表达差异；设15名肝硬化患者及15名健康人为对照组。结果（1）HBV-ACLF患者CD8^＋T细胞上PD-1较肝硬化组和健康组表达上调（P〈0．05）；好转组PD-1表达率低于无效组（P〈0．05）；早、中、晚三期PD-1表达率呈上升趋势（P〈0．05）；（2）PD—L1在好转组及病情早期表达相对最低；（3）PD-1与CD95在死亡组表达明显升高；穿孔素、颗粒酶及CD107a在死亡组表达升高，但PD-1在这三类细胞上表达率非常低。结论PD-1在***患者外周血CD8^＋T细胞上表达上调，且与病情严重程度呈正比。其上调表达可能促进总CD8^＋T细胞的凋亡，但对于具有杀伤活性的CD8^＋T细胞抑制作用相对较弱。

关键词：肝功能衰竭程序性死亡分子 CD8阳性T淋巴细胞

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1例多药耐药慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因突变的5年动态分析

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中华肝脏病杂志 2008年第7期16卷 497-499页

作者：李晓东王琳李梵貌盼勇王慧芬徐东平解放军第三0二医院全军传染病研究所北京100039 肝衰竭治疗研究中心

目的动态检测乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因和前C及基本核心启动子（BCP）区基因突变，分析基因突变与核苷（酸）类似物耐药、HBeAg阴转的关系。方法收集1例在我院14次住院治疗患者血清18份，提取DNA，采用巢式PCR法扩增HBV靶基因片段，... 详细信息

目的动态检测乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因和前C及基本核心启动子（BCP）区基因突变，分析基因突变与核苷（酸）类似物耐药、HBeAg阴转的关系。方法收集1例在我院14次住院治疗患者血清18份，提取DNA，采用巢式PCR法扩增HBV靶基因片段，对PCR产物进行DNA双向测序，NTI软件对比分析结果，分析逆转录酶基因12个耐药位点和前C／BCP区6个位点上的突变情况，结合临床资料解析突变意义。结果先后检测到了引起拉米夫定耐药的M204I／V共生突变、L180M＋M204V突变，引起恩替卡韦耐药的S202G突变，以及引起HBeAg阴转的G1896A突变，检测结果与临床病情发展情况符合。结论采用DNA序列测定方法可以全面了解HBV基因突变，有助于临床监测病情发展，合理进行抗病毒治疗。

关键词：肝炎病毒乙型突变耐药

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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因克隆化的研究

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中华肝脏病杂志 2003年第1期11卷 5-7页

作者：刘妍成军陆荫英王刚牟劲松李莉张玲霞陈菊梅中国人民解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心北京100039

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBX反式激活相关基因。方法以HBX表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的... 详细信息

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBX反式激活相关基因。方法以HBX表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HBX反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到85个白色克降,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的65个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得19种已知基因序列,和15个未知基因。结论应用SSH技术成功构建了HBX反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HBX反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。

关键词：乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因克隆化研究

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抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒F蛋白的反式调节基因

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中华肝脏病杂志 2005年第9期13卷 660-663页

作者：郭江成军纪冬赵龙凤高学松刘妍吴顺华北京地坛医院传染病研究所 100011 解放军第三0二医院传染病研究所基因治疗研究中心山西医科大学第一附属医院

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA,克隆HCV F蛋白反式激活相关基因。方法以HCV F表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1 (-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经... 详细信息

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA,克隆HCV F蛋白反式激活相关基因。方法以HCV F表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1 (-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆聚合酶链反应后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HCV F蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个200-1000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中28个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得19种编码基因,其中2个为未知功能的新基因。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。

关键词：肝炎病毒,丙型反式激活(遗传学) F蛋白抑制性消减杂交技术克隆聚合酶链反应丙型肝炎病毒反式调节基因筛选 pcDNA3 HepG2细胞

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丙型肝炎病毒包膜蛋白E2可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

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中国病毒学 2001年第3期16卷 220-223页

作者：成军施双双钟彦伟夏小兵王刚王琳刘妍陈菊梅解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心北京100039

利用分子生物学技术 ,构建表达丙型肝炎病毒 (HCV)包膜蛋白E2的人源单链可变区抗体 (ScFv)的原核表达载体 ,并在大肠杆菌JM10 9中表达可溶性的HCV E2 ScFv。以重组的HCVE2蛋白为包被抗原 ,利用噬菌体抗体库的表面展示技术 ,筛选到含有H... 详细信息

利用分子生物学技术 ,构建表达丙型肝炎病毒 (HCV)包膜蛋白E2的人源单链可变区抗体 (ScFv)的原核表达载体 ,并在大肠杆菌JM10 9中表达可溶性的HCV E2 ScFv。以重组的HCVE2蛋白为包被抗原 ,利用噬菌体抗体库的表面展示技术 ,筛选到含有HCV E2 ScFv基因的噬菌体克隆 ,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒 ,经Ncol/NotI酶切鉴定后 ,该ScFv基因由 75 0bp组成 ,将其亚克隆到pCANTAB5E载体中 ,转化大肠杆菌JM10 9,提取质粒进行DNA序列测定 ,符合ScFv的基因结构特点。IPTG诱导转化的大肠杆菌JM10 9,在其培养上清中获得了可溶性HCVE2单链可变区抗体的表达。酶联免疫吸附法 (ELISA)证实表达的HCV E2 ScFv具有与重组HCVE2蛋白的反应活性和特异性 ,对转化的JM10 9大肠杆菌上清中表述的HCV E2 ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) ,证实表达的HCV E2 ScFv的分子量为 2 8kD。为应用HCV E2 ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础。

关键词：丙型肝炎病毒包膜蛋白单链可变区抗体表达大肠杆菌

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酵母双杂交技术筛选乙型肝炎e抗原反式激活蛋白结合蛋白的基因

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中华肝脏病杂志 2005年第4期13卷 245-248页

作者：王建军成军刘敏杨倩蔺淑梅刘妍解放军第三0二医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京100039 北京地坛医院传染病研究所

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎e抗原反式激活蛋白(HBeAgTP)相互作用蛋白的基因。方法应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆HBeAg反式激活的新型靶基因HBeAgTP。用聚合酶链反应(PCR)法扩增HBeAgTP基因,连接... 详细信息

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎e抗原反式激活蛋白(HBeAgTP)相互作用蛋白的基因。方法应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆HBeAg反式激活的新型靶基因HBeAgTP。用聚合酶链反应(PCR)法扩增HBeAgTP基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析。结果成功克隆出HBeAgTP基因并在酵母细胞中表达,应用酵母双杂交筛选出阳性菌落24个,经生物信息学分析为15种已知基因。结论成功克隆出HBeAgTP的结合蛋白,包括一些与细胞内蛋白质的转录、翻译、免疫调节及物质和能量代谢相关的基因。

关键词：酵母双杂交技术筛选乙型肝炎e抗原反式激活蛋白结合蛋白基因

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慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒DNA序列异质性及准种特点的研究

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中华医学杂志 2002年第2期82卷 81-85页

作者：董菁成军王勤环皇甫竞坤施双双张国庆洪源李莉斯崇文解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心北京100039 北京大学第一医院感染疾病科

目的　以乙型肝炎病毒 (HBV)基因异质性来探讨HBV准种群在慢性感染者中的存在状态。方法　应用聚合酶链反应 (PCR)法 ,自 18例慢性患者血清中分别扩增前C/C基因、P基因逆转录酶区 (RT)、HBV全S区、X基因和全基因组序列 ,克隆入pGEMTeas... 详细信息

目的　以乙型肝炎病毒 (HBV)基因异质性来探讨HBV准种群在慢性感染者中的存在状态。方法　应用聚合酶链反应 (PCR)法 ,自 18例慢性患者血清中分别扩增前C/C基因、P基因逆转录酶区 (RT)、HBV全S区、X基因和全基因组序列 ,克隆入pGEMTeasy质粒 ,挑选 81克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果　除外大段缺失突变的克隆 ,来源于同一患者前C/C区、RT区、全S区、X区和全基因组不同克隆之间的碱基序列同源性分别为 98 0 %～ 99 1%、98 7%～ 99 3%、97 5 %～ 10 0 %、93 0 %～ 98 2 %和 96 6 %～ 97 5 %。前C区A83点突变、C抗原内部缺失较为常见 ,缺失突变、终止替换突变、短序列的插入或缺失突变造成的移框突变在各个区域中均可检出 ,X基因 (核心蛋白启动子区 ,CP)内部缺失突变不仅导致X蛋白羧基端的多样性 ,而且调控HBeAg的表达。编码截短型表面抗原中蛋白和缺陷病毒基因亦在患者外周血中。结论　多区域测序结果提示HBV慢性患者体内HBV呈现准种群共存 ,X区 (CP区 )内存在热点缺失突变区 ,CP区的变异可能影响前C蛋白的表达 ,这些变异可能与患者不良预后有关。

关键词：患者缺失突变体内准种 HBV CP 乙型肝炎病毒DNA 变异种群全基因组序列

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低密度脂蛋白受体的研究进展

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中华肝脏病杂志 2003年第3期11卷 190-192页

作者：成军李莉中国人民解放军第三0二医院传染病研究所基因治疗研究中心北京100039

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)受体的研究,主要集中在CD81分子和低密度脂蛋白受体(low density li-poprotein-receptor,LDL-R)两种穿膜蛋白分子上[1].最近的研究表明,LDL-R可能是H CV感染肝细胞的受体候选分子[2].

关键词：低密度脂蛋白受体研究进展丙型肝炎病毒

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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

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中华肝脏病杂志 2005年第10期13卷 738-740页

作者：刘妍白桂芹成军吴顺华王琳严福明张玲霞崔玉芳解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京100039 北京地坛医院传染病研究所

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4A(NS4A) 相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3,将聚合酶链反应法扩增的HCV NS4A基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细... 详细信息

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4A(NS4A) 相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3,将聚合酶链反应法扩增的HCV NS4A基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌,接种在氨苄青霉素-LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析。结果成功克隆出HCV NS4A基因, 构建表达载体并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在四缺培养基又能在铺有X-α-半乳糖的四缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落22个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞能量代谢、蛋白翻译合成等多种生物学过程。结论成功克隆出HCV NS4A蛋白在肝细胞内的结合蛋白, 为进一步研究NS4A蛋白的功能、阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索。

关键词：肝炎病毒,丙型病毒非结构蛋白基因表达肝细胞结合蛋白酵母双杂交丙型肝炎病毒(HCV) 非结构蛋白NS4A 结合蛋白基因人肝细胞克隆

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人源抗丙型肝炎病毒包膜蛋白E2单链抗体的研究

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中华肝脏病杂志 2002年第2期10卷 109-112页

作者：钟彦伟成军施双双王刚夏小兵田小军李莉张玲霞陈菊梅中国人民解放军第三O二医院传染病研究所基因治疗研究中心北京100039

目的研制抗丙型肝炎病毒包膜蛋白Ｅ２（ＨＣＶＥ２）的人源噬菌体单链抗体，并探讨其临床价值。方法以重组的ＨＣＶＥ２为固相抗原，利用亲和筛选的原理，从噬菌体抗体库中经过５轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试... 详细信息

目的研制抗丙型肝炎病毒包膜蛋白Ｅ２（ＨＣＶＥ２）的人源噬菌体单链抗体，并探讨其临床价值。方法以重组的ＨＣＶＥ２为固相抗原，利用亲和筛选的原理，从噬菌体抗体库中经过５轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和ＤＮＡ序列分析，获得ＨＣＶ　Ｅ２的人源单链抗体；用该抗体对１０例石蜡包埋的丙型肝炎患者肝组织进行免疫组织化学鉴定。结果ＥＬＩＳＡ结果表明，制备的ＨＣＶＥ２人源单链抗体（吸光度值Ａ４５０为１．８８）能与ＨＣＶＥ２抗原特异性结台；免疫组织化学结果表明，该抗体能够特异性识别丙型肝炎患者肝组织ＨＣＶＥ２抗原，与正常肝组织及乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）抗原均无交叉反应。结论此法制备的单链抗体亲和性好，特异性强，且制备方法简便，周期短，为ＨＣＶＥ２病原的检测提供了新的有效的试剂。

关键词：人源抗丙型肝炎病毒包膜蛋白E2 单链抗体研究免疫组织化学

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