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中国奶业协会第24次繁殖学术年会暨国家奶牛/肉牛产业技术体系第一届全国牛病防治学术研讨会

作者：刘颖刘华兰杨利国陈焕春郭爱珍湖北省华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北省华中农业大学动物医学院预防兽医学省重点实验室湖北省华中农业大学动物科技学院

提取经植物血凝素诱导培养的我国健康奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛β-干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为奶牛β-干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100... 详细信息

提取经植物血凝素诱导培养的我国健康奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛β-干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为奶牛β-干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌BL21中实现了高效表达。表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的40%。用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性。重组奶牛β-干扰素抗病毒活性分别约3.16×10～5 U/mL,7.5×10～4 U/mL。结果表明重组奶牛β-干扰素特异性好,而且抗病毒活件比较稳定。本研究为研制和开发重组奶牛β-干扰素类生物制品研发奠定了基础。

关键词：奶牛 β-干扰素融合蛋白抗病毒活性

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人IFN-γ体外释放检测法的建立及其在结核病诊断中的应用

人IFN-γ体外释放检测法的建立及其在结核病诊断中的应用

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中国奶业协会第24次繁殖学术年会暨国家奶牛/肉牛产业技术体系第一届全国牛病防治学术研讨会

作者：陈颖钰邓铨涛詹枝华郭爱珍项杰陈军周金海曾庆志杜义祥魏武童庆伟晁彦杰匡有吉陈焕春华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院预防兽医学省重点实验室武汉市结核病医院武汉市结核病防治所华中农业大学校医院

本研究旨在建立人IFN-γ体外释放检测法,用于人结核病的特异性诊断。克隆表达了人IFNγ7基因,利用纯化的重组IFN-γ免疫小鼠,获得两株高效价的单克隆抗体。用所获得的单克隆抗体及兔抗IFN-γ多克隆抗体建立了检测人IFN-γ的夹心ELISA,... 详细信息

本研究旨在建立人IFN-γ体外释放检测法,用于人结核病的特异性诊断。克隆表达了人IFNγ7基因,利用纯化的重组IFN-γ免疫小鼠,获得两株高效价的单克隆抗体。用所获得的单克隆抗体及兔抗IFN-γ多克隆抗体建立了检测人IFN-γ的夹心ELISA,检测灵敏度达到31.25 pg/mL。采集111位结核病阳性病人与292位临床健康对照者肝素抗凝全血,利用结核菌特异性抗原ESAT-6/CFP-10融合蛋白体外刺激外周血淋巴细胞释放IFN-γ,用所建立的夹心ELISA及商品化试剂盒平行检测所有样本,结果两种方法的检测结果相符。结核患者的检测灵敏度为95.5%,健康对照的阳性检出率为16.7%,患者与健康对照的阳性检出率差异极显著(P<0.01),证实所建立的方法灵敏度与特异性均很高,具有良好的应用前景。

关键词：结核病 IFN-γ 诊断 ELISA ESAT-6/CFP-10 单克隆抗体

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金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220 nuc1的构建

金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220 nuc1的构建

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中国食品科学技术学会第六届年会暨第五届东西方食品业高层论坛

作者：唐俊妮周锐康名松陈焕春史贤明上海交通大学农业与生物学院食品科学与工程系陆伯勋食品安全研究中心华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室四川大学生命科学学院四川大学动物疾病防控生物工程研究中心华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一... 详细信息

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失。本研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2nuc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株。经过了七轮培养和筛选,同源重组几率为2%(7/345),筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220 nuc1。

关键词：金黄色葡萄球菌 nuc1 nuc2同源重组突变株构建

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免疫组织化学方法诊断猪圆环病毒病的研究

免疫组织化学方法诊断猪圆环病毒病的研究

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第七届全国生物医学体视学学术会议、第十届全军军事病理学学术会议、第六届全军定量病理学学术会议

作者：林涛汪开毓邓桦何启盖马春全四川农业大学动物医学学院四川雅安 625014 佛山科学技术学院生命科学学院广东佛山 528231 华中农业大学动物医学院预防兽医学湖北重点实验室武汉 430070 农业微生物学国家重点实验室武汉 430070

猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus 2，pcv2)是仔猪断奶后多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic waxing syndrome，PWMS)的病原。目前pcv2已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一，并给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损... 详细信息

猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus 2，pcv2)是仔猪断奶后多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic waxing syndrome，PWMS)的病原。目前pcv2已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一，并给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒存在pcv1和pcv2两种血清型。其中pcv1没有致病性，但却普通存在于猪群和各种猪源传代细胞中，但是pcv2具有致病性，常和prrs，ppv，pnds等混合感染，引起免疫失败。pcv1和pcv2的ORF2编码的病毒结构蛋白具有良好的抗原性，且不发生血清学交叉反应。所以猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白是很好的免疫原。以该抗原作为研究对象建立临床简单有效的检测方法。

关键词：猪圆环病毒Ⅱ型免疫组织化学法重组蛋白

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金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220 △nuc1的构建

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畜牧市场 2009年第1期 21-24页

作者：唐俊妮周锐史贤明康名松陈焕春上海交通大学农业与生物学院食品科学与工程系陆伯勋食品安全研究中心华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室四川大学生命科学学院四川大学动物疾病防控生物工程研究中心

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcalnuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个... 详细信息

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcalnuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失。研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2△nuc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株。经过了7轮培养和筛选,同源重组几率为2%(7/345),筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220△nuc1。

关键词：金黄色葡萄球菌nuc1 nuc2 同源重组突变株构建

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胸膜肺炎放线杆菌萘啶酸抗性菌株的选育和信号标签突变株的构建

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微生物学报 2008年第1期48卷 73-79页

作者：商霖李薇李良军黎璐张四化李婷婷李耀坤刘磊郭志伟周锐陈焕春农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院武汉430070

胸膜肺炎放线杆菌(APP)是重要的猪呼吸道病原菌,给世界养猪业造成严重的经济损失.信号标签突变(STM)技术是在宿主动物体内鉴定病原菌毒力因子的高通量方法.通过体外传代选育出APP血清1型和3型萘啶酸抗性菌株,再以萘啶酸抗性菌株为受体菌... 详细信息

胸膜肺炎放线杆菌(APP)是重要的猪呼吸道病原菌,给世界养猪业造成严重的经济损失.信号标签突变(STM)技术是在宿主动物体内鉴定病原菌毒力因子的高通量方法.通过体外传代选育出APP血清1型和3型萘啶酸抗性菌株,再以萘啶酸抗性菌株为受体菌,以携带mini-Tn10的标签质粒(pLOF/TAG1-48)的*** CC118 λ pir或S17-1λpir为供体菌,在或不在*** DH5α(pRK2073)的辅助下,进行三亲本或两亲本接合,通过抗性筛选、PCR和Southern杂交鉴定转座突变株.结果表明:体外萘啶酸加压传代很容易选育出萘啶酸抗性APP菌株,该抗性的产生与DNA促旋酶A亚基基因gyrA的突变有关.在APP与E. coli接合实验中,两亲本接合比三亲本接合操作更简单,效率也较高;APP不同菌株在接合和转座效率上存在很大差异,血清1型菌株高于血清3型菌株,3型标准菌株高于地方分离株JL03-R.本研究为APP STM突变体库的构建与毒力基因的鉴定奠定了基础.

关键词：胸膜肺炎放线杆菌萘啶酸抗性信号标签突变细菌接合

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Asia Ⅰ口蹄疫vp2蛋白单克隆抗体的制备及单抗竞争ELISA方法的建立

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生物工程学报 2008年第9期24卷 1664-1669页

作者：向敏张克山卢顺蔡利军罗勇张建民何华王勤刚吴斌华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070

制备AsiaI口蹄疫病毒vp2单克隆抗体(mAb)并建立了单抗竞争ELISA方法。用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒vp2重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞。分别用ELISA、Western ... 详细信息

制备AsiaI口蹄疫病毒vp2单克隆抗体(mAb)并建立了单抗竞争ELISA方法。用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒vp2重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞。分别用ELISA、Western blotting检测mAb腹水的效价及其特异性。筛选到杂交瘤细胞2株,腹水效价均在100×29以上;以纯化后的AsiaI型口蹄疫病毒vp2重组蛋白作为抗原,利用AsiaI型口蹄疫病毒vp2单抗酶标物建立了竞争ELISA方法用来检测AsiaI型口蹄疫抗体。临床应用表明,该方法与UBI公司的口蹄疫全病毒抗体检测试剂盒总符合率达89.0%,和荷兰赛迪公司的口蹄疫病毒LPB-ELISA抗体检测试剂盒总符合率达86.5%。

关键词：口蹄疫单抗竞争ELISA 单克隆抗体 vp2蛋白

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猪源支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素基因的原核表达及其抗体检测ELISA方法

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微生物学报 2008年第3期48卷 330-336页

作者：赵战勤薛云吴斌汤细彪陈焕春李增强胡睿铭张建民段龙川华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070

[目的]以猪源支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的原核表达产物为抗原建立检测PRN抗体的间接ELISA方法。[方法和结果]利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统对PRN基因在大肠杆菌中进行融合表达... 详细信息

[目的]以猪源支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的原核表达产物为抗原建立检测PRN抗体的间接ELISA方法。[方法和结果]利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统对PRN基因在大肠杆菌中进行融合表达。SDS-PAGE和Westernblot检测证实该基因获得高效表达,产物易于纯化且具有良好的免疫学活性。通过凝血酶酶切GST-PRN并回收,获得不含GST载体蛋白的PRN蛋白片段。以PRN蛋白片段为抗原建立检测天然PRN抗体的间接ELISA方法。该方法对猪巴氏杆菌病等7种常见细菌性疾病阳性血清的检测结果均为阴性,其敏感性比乳胶凝集试验提高4～128倍,能检测到人工感染14d后的仔猪血清抗体IgG,对临床送检的1,229份猪血清的检测阳性率为32.7%。ELISA方法对阳性猪场的监测结果预示了保育期仔猪的合群导致猪群大量感染支气管败血波氏杆菌。[结论]该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于猪群PRN抗体水平监测和猪波氏菌病流行病学调查。

关键词：支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素 ELISA

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H1N1亚型猪流感病毒的拯救

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生物工程学报 2008年第5期24卷 857-861页

作者：彭亚平周红波李春金梅林华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070

利用8质粒拯救系统成功拯救出了猪流感病毒毒株A/Swine/TianJin/01/2004(H1N1)(A/S/TJ/04)。将猪流感病毒8个基因节段经RT-PCR合成cDNA后,分别克隆到RNA聚合酶I/II双向表达载体PHW2000中,构建成8个重组质粒。用8个重组质粒共转染COS-1细... 详细信息

利用8质粒拯救系统成功拯救出了猪流感病毒毒株A/Swine/TianJin/01/2004(H1N1)(A/S/TJ/04)。将猪流感病毒8个基因节段经RT-PCR合成cDNA后,分别克隆到RNA聚合酶I/II双向表达载体PHW2000中,构建成8个重组质粒。用8个重组质粒共转染COS-1细胞,30h后加入TPCK-胰酶至终浓度0.5μg/mL。共转染48小时后收获COS-1细胞及其上清,经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚。收获死亡鸡胚尿囊液并继续用SPF鸡胚传3代,得到有感染性的病毒。经血凝、血凝抑制验、测序分析、电镜观察等均证实了A/S/TJ/04猪流感病毒的成功拯救。这是目前国内首次报道拯救出H1N1亚型猪流感病毒,为进一步研究猪流感病毒基因组结构与功能的关系、流感跨种传播的机制以及构建新型猪流感疫苗株奠定了基础。

关键词：猪流感病毒双向表达载体拯救共转染

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重组百日咳杆菌黏附素蛋白免疫小鼠可完全抵抗支气管败血波氏杆菌的致死性感染

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微生物学报 2008年第3期48卷 337-341页

作者：赵战勤薛云吴斌段龙川陈焕春汤细彪胡睿铭何华李增强华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070

【目的】通过建立的小鼠呼吸道感染模型评价重组百日咳杆菌黏附素蛋白(GST-PRN)对小鼠的免疫保护效力。【方法和结果】在主动免疫保护试验中,GST-PRN免疫组小鼠能产生较高的PRN抗体水平,在使用3×LD50的支气管败血波氏杆菌HH0809株... 详细信息

【目的】通过建立的小鼠呼吸道感染模型评价重组百日咳杆菌黏附素蛋白(GST-PRN)对小鼠的免疫保护效力。【方法和结果】在主动免疫保护试验中,GST-PRN免疫组小鼠能产生较高的PRN抗体水平,在使用3×LD50的支气管败血波氏杆菌HH0809株进行呼吸道气雾攻毒后,其保护率为100%(20/20),但载体蛋白GST和PBS对照组小鼠的存活率仅为15%(3/20)和20%(4/20)。在被动免疫保护试验中,腹腔免疫GST-PRN兔抗血清能100%(10/10)保护小鼠抵抗10×LD50的HH0809株的腹腔攻击,但GST兔抗血清和PBS免疫组小鼠的存活率均为0(0/10和0/9)。【结论】研究结表明重组PRN蛋白具有良好的免疫学活性,可作为亚单位疫苗或疫苗添加成分。

关键词：支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素免疫原性

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