检索结果-内蒙古大学图书馆

中国奶牛 2007年第10期 16-20页

作者：吴波张书环邓铨涛项杰陈军刘朝陈鑫宋念华陶淑珍黄继根韩永佩赵波林祥梅陈焕春郭爱珍华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北省武汉市结核病防治院(所) 武汉430083 湖北省动物疫病诊断中心武汉430064 武汉市动物防疫检疫站武汉430015 武汉市奶业管理办公室武汉430015 湖北省宜昌市夷陵区畜牧局宜昌443100 宜昌市夷陵区奶牛养殖技术服务中心宜昌443100 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所北京100029

以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。该iELISA与导致常见牛病的非相关抗原无交叉反应。用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。与商品化胶体金... 详细信息

以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。该iELISA与导致常见牛病的非相关抗原无交叉反应。用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛血清样本,结果与ICG的符合率为93.33%(140/150)。以结核菌素皮内试验(TST)为参考方法,检测了华中地区四个奶牛场的560头中国荷斯坦奶牛和90份进口奶牛结核阴性血清,结果iELISA与TST的总符合率为87.32%(489/560)。对其中22头奶牛进行鼻拭子分菌检验,4头分菌阳性奶牛的血清抗体检测也为阳性,iELISA与细菌培养的总符合率为77.27%(17/22)。以TST为参考方法,iELISA的敏感性和特异性分别为72.37%和89.67%。

关键词： iELISA 融合蛋白牛结核病 MPB70 MPB83 CFP10 ESAT-6

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特异性抑制伪狂犬病毒EP0基因表达的siRNA分子的合成与筛选

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中国病毒学 2006年第6期21卷 565-570页

作者：习杨周锐郭洪胡勤芹方六荣陈焕春华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

EP0基因是伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)的早期基因,可能与病毒复制及潜伏感染等有关。为了筛选特异性抑制EP0基因表达的siRNA序列,本研究按照Ambion公司公布的siRNA分子设计原则,设计并合成了3个针对PRVEa株EP0基因的siRNA模板EP0... 详细信息

EP0基因是伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)的早期基因,可能与病毒复制及潜伏感染等有关。为了筛选特异性抑制EP0基因表达的siRNA序列,本研究按照Ambion公司公布的siRNA分子设计原则,设计并合成了3个针对PRVEa株EP0基因的siRNA模板EP04、EP08和EP12,分别克隆到以CMV启动子的siRNA表达载体pSilencer4.1-CMVneo中,构建相应的重组表达质粒p4.1-EP04、p4.1-EP08和p4.1-EP12。同时,将EP0基因的编码区克隆到真核表达载体pEGFP-N3中,按照读码框架与EGFP基因的5’端融合,获得重组表达质粒pEP0-EGFP。将p4.1-EP04、p4.1-EP08、p4.1-EP12和阴性对照质粒p4.1-NK分别与pEP0-EGFP共转染IBRS-2细胞,荧光显微镜观察、流式细胞仪和半定量RT-PCR检测结果表明,三个siRNA分子均能不同程度地抑制EP0基因的表达,抑制效率从高到低依次为EP08、EP12和EP04;在进一步的病毒感染实验中也得到了与细胞转染模型一致的结论。这为深入研究EP0基因在PRV复制和潜伏感染中的作用奠定了基础。

关键词： siRNA 伪狂犬病毒 EPO

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猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因的克隆与表达

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中国兽医学报 2006年第3期26卷 271-274页

作者：王大鹏吴斌周锐唐先春陈焕春华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物传染病分室湖北武汉430070

皮肤坏死毒素(Dermonecrotictoxin,DNT)是产毒素多杀性巴氏杆菌(ToxigenicPasteurellamultocida,T+Pm)的主要毒力因子和保护性抗原。以猪源D型T+Pm的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到了编码DNT的toxA全基因编码序列,共4019bp。将其克隆到pMD18-T载体并测序,结果表明,toxA基因序列与GenBank已报道的5个toxA基因序列的同源性达99.8%以上。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-KG的GST基因下游,转化BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达,获得大小约173000的融合蛋白。Westernblot结果表明,该融合蛋白具有良好的反应原性。动物试验表明,该重组蛋白可以诱导小鼠产生高水平的抗体,并可抵抗致死剂量的天然DNT毒素攻击。

关键词：猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌 toxA基因克隆表达

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弓形虫SAGⅠ基因的克隆与原核表达

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华中农业大学学报 2006年第1期25卷 9-12页

作者：王金苹赵俊龙江涛周艳琴刘琴付媛姚宝安华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 华中农业大学动物医学院武汉430070

利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出SAGⅠ部分基因片段,亚克隆入表达载体pGEX-KG,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示表达的重组蛋白的分子量为56ku。免疫印记分析显示此表达产物能被猪抗弓形虫阳性血清... 详细信息

利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出SAGⅠ部分基因片段,亚克隆入表达载体pGEX-KG,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示表达的重组蛋白的分子量为56ku。免疫印记分析显示此表达产物能被猪抗弓形虫阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有免疫反应活性。为进一步进行弓形虫病的免疫预防和诊断研究奠定了基础。

关键词：弓形虫 SAGⅠ基因基因表达基因克隆弓形虫病

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弓形虫微线体蛋白MIC3基因的克隆及原核表达

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畜牧兽医学报 2006年第6期37卷 587-591页

作者：江涛周艳琴刘琴聂浩姚宝安赵俊龙华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 华中农业大学动物医学院武汉430070

根据编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,克隆入pGEX-KG表达载体,转化入***5α感受态细胞,经含氨苄青霉素琼脂平板筛选,小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定。... 详细信息

根据编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,克隆入pGEX-KG表达载体,转化入***5α感受态细胞,经含氨苄青霉素琼脂平板筛选,小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定。然后阳性重组质粒转化入***21-CodonPlus,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank中相应基因序列(AJ132530)的同源性达99.6%,表达的MIC3融合蛋白表观分子量约为66 ku,且可被兔抗弓形虫免疫血清识别。说明所获得的表达蛋白质具有一定的反应原性,为下一步利用重组蛋白建立弓形虫的诊断方法和研制弓形虫的亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：龚地弓形虫 MIC3 基因克隆表达

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检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用

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中国预防兽医学报 2006年第2期28卷 220-225页

作者：汪招雄何启盖刘丽娜刘正飞黄红亮陈焕春华中农业大学动物医学院预防兽医学湖北省重点实验室农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

以猪伪狂犬病病毒(PrV)Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体,纯化的抗PrVIgG为检测抗体,建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为,单克隆抗体576株的包被浓度为12.2μg/mL,IgG的工作浓度为16.0μg/mL,对PrV的检测灵敏... 详细信息

以猪伪狂犬病病毒(PrV)Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体,纯化的抗PrVIgG为检测抗体,建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为,单克隆抗体576株的包被浓度为12.2μg/mL,IgG的工作浓度为16.0μg/mL,对PrV的检测灵敏度达15.6ng(0.156μg/mL),与乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪流感病毒(SIV)等无交叉反应。批间和批内变异系数较小,分别为6.39%和4.1%。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测,肺和脑PrV抗原检出率最高,其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测,发现二者的符合率可达到77.4%,比PCR敏感。实验结果表明:双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点,可广泛应用于动物组织中PrV的检测。

关键词：双抗体夹心间接ELISA 单克隆抗体猪伪狂犬病毒Ea株

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研究胸膜肺炎放线杆菌的流行病学方法: 分型的新方法及对未来的展望

研究胸膜肺炎放线杆菌的流行病学方法: 分型的新方法及对未来的展...

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亚洲猪病学会第三届学术会议

作者： Zhou L Rycroft AN Langford PR Jones SCP Bossé JT Angen Φ Nash JHE Zhou R Hanage WP Spratt BG Kroll JS 帝国理工大学圣玛丽学院儿科伦敦W2 1PG英国伦敦大学皇家兽医学院病理和传染病学系北麦恩赫特福郡AL9 7TA英国丹麦动物医学研究室布洛斯威27DK-1790哥本哈根丹麦加拿大国家研究委员会生命科学学院病原菌基因组研究组渥太华安大略湖K1A 0R6加拿大华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室狮子山街1号武汉 430070中国帝国理工大学圣玛丽学院传染病流行病学系伦敦W2 1PG英国

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失.分型作为当前菌株鉴定的金规则已经成为流行病学监控主要手段,为进行正确治疗,防疫疾病或实施扑灭计划提供了有用... 详细信息

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失.分型作为当前菌株鉴定的金规则已经成为流行病学监控主要手段,为进行正确治疗,防疫疾病或实施扑灭计划提供了有用的指导.胸膜肺炎放线杆菌有16种血清型(1-4,5a,5b,6-15),在不同区域流行着不同优势血清型。经典的血清分型方法是利用兔血清与不同表面多糖之间发生的免疫反应。传统的血清分型的方法包括补体结合实验,间接血凝实验,ELISA,凝集实验,乳胶凝集反应,间接荧光抗体标记技术,免疫扩散,环状沉淀试验.这些实验都有共同的缺陷:个别批次被检验的血清检验结果重复性不好,而且不同的血清型之间有着交叉反应,如在3、6、和8型之间存在交叉反应。为了避免使用免疫学方法,研究们选择了基因分型的方法,如利用多重PCR反应可以鉴定血清型为2、5、6和8型的菌株.现在本文介绍一种3型菌的特异PCR,它可以和Apx Ⅳ基因的特异PCR组合成多重PCR.其他用于流行病学和的鉴定研究方法还有核糖分型,核糖体基因间区域序列分析,脉冲场凝胶电泳,限制酶切指纹,aroA基因PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP),16S RNA的序列分析,RAPD分析和脉冲场凝胶电泳等等。目前,通过分析表达了ApxⅠ-Ⅲ和外膜蛋白OmlA的基因已经用于基因分型。然而通过己发表的三篇论文对胸膜肺炎放线杆菌进行多位点。酶电泳分析(MLEE)研究,可以推测多位点。序列分析(MLST)将会是这种重要病原菌在流行病学和进化研究中的一个有用的工具.MLST包含互不相邻而分散于基因组中可能和免疫选择相关的7个看家基因的DNA序列.MLST不同与传统实验室技术所产生的含糊数据,它可以通过互联网与全世界其他实验室快速分享数据。通过检测从丹麦,中国和英国分离菌株所得到的前期数据显示:MLST在血清分型上更清晰确切,而且在流行病学研究和从微观(动物)与宏观(所有生物)上理解胸膜肺炎放线杆菌的进化都显示出了重要性。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌流行病学多位点酶电泳分析

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温氏附红细胞体16S rRNA基因的序列测定和分析

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畜牧兽医学报 2006年第5期37卷 518-522页

作者：付媛李树清杜凯刘琴周艳琴刘恩勇姚宝安赵俊龙华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 上海进出口检验检疫局上海200135 华中农业大学动物医学院武汉430070 湖北省兽疫防治站武汉430064

从自然感染附红细胞体的湖北黄牛无菌采集血液,分离附红细胞体并提取病原基因组,用血营养菌的16SrRNA基因的通用引物进行PCR扩增,得到长约1.5 kb的扩增片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行测序和分析。结果表明该片段全长为1 471 bp(GenB... 详细信息

从自然感染附红细胞体的湖北黄牛无菌采集血液,分离附红细胞体并提取病原基因组,用血营养菌的16SrRNA基因的通用引物进行PCR扩增,得到长约1.5 kb的扩增片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行测序和分析。结果表明该片段全长为1 471 bp(GenBank收录号为AY946266),同源性分析表明该序列与Neimark公布的温氏附红细胞体(AF016546)的16S rRNA基因序列同源性达到98.7%,证实该病原为温氏附红细胞体,从分子生物学水平证实了温氏附红细胞体在湖北省的存在。将该序列与5种支原体、14种血营养菌及边缘无浆体等的相应序列进行比较,建立系统发育树,结果表明温氏附红细胞体同边缘无浆体的关系较远,而与肺炎支原体组的亲缘关系较近。

关键词：温氏附红细胞体 16S rRNA PCR 序列分析

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猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ基因的克隆、表达及其免疫原性

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农业生物技术学报 2006年第4期14卷 493-497页

作者：严克霞刘建杰吴斌汤细彪蔡利军杨明柳陈焕春周锐华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室动物病原分室武汉430070 海口农工贸(罗牛山)股份有限公司海口570125

以本实验室分离的猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2,APP-2)菌株HB08的基因组为模板,扩增了2871 bp的APP毒素Ⅱ的结构基因apxⅡA,并克隆到pET-28a原核表达载体中构建重组表达质粒pET28aⅡA,转化到... 详细信息

以本实验室分离的猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2,APP-2)菌株HB08的基因组为模板,扩增了2871 bp的APP毒素Ⅱ的结构基因apxⅡA,并克隆到pET-28a原核表达载体中构建重组表达质粒pET28aⅡA,转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经SDS-PAGE和Westernblot分析表明,表达的重组蛋白具有良好的反应活性.将表达的蛋白经或不经复性处理,与纯化的天然毒素Ⅱ分别免疫昆明小鼠,同时设PBS空白对照组,每组12只,间隔2周免疫2次,采血检测其抗体效价,二免后2周用致死剂量的APP血清7型(APP-7)菌株(1.08× 108CFU(菌落形成单位,colony form unit)/只)腹腔攻击.结果显示,复性蛋白组的保护率为83.3%,非复性蛋白组的保护率为58.3%,天然毒素蛋白对照组保护率为91.7%,空白对照组小鼠全部死亡,说明复性的重组毒素Ⅱ具有良好的免疫原性.

关键词：胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ 克隆原核表达免疫原性

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弓形虫ROP2基因的克隆及原核表达

弓形虫ROP2基因的克隆及原核表达

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会

作者：江涛周艳琴刘琴聂浩姚宝安赵俊龙华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院华中农业大学农业微生物学国家重点实验室

应用PCR技术从刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株的基因组DNA中扩增编码ROP2 (rhpotry protein 2)的部分基因,构建pGEX-KG-ROP2重组表达质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转入***21CodonPlus中在IPTG诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。结果表明,扩增的ROP2基因与GenBank上发表的相应基因序列的同源性达99．9％,该基因可以在大肠杆菌中高效表达,表达的ROP2融合蛋白表观分子量约为64 kd,可被兔抗弓形虫免疫血清识别。本研究为下一步利用重组蛋白研制弓形虫病的诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。

关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白ROP2 基因克隆原核表达

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