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中国动物传染病学报 2022年第2期30卷 203-207页

作者：陈颖钰李翔郭爱珍国家动物结核病专业实验室(武汉) 武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学武汉430070 华中农业大学动物医学院武汉430070 华中农业大学动物科技学院武汉430070

牛结核病和布鲁菌病在民间俗称“两病”,不仅是影响奶牛业发展的重要疫病,还给公共卫生也带来巨大威胁。随着“两病”控制及净化力度的不断加大,对两病的安全高效检测及监测手段也提出了更高的要求。奶样检测具有无应激、适合监测、降... 详细信息

牛结核病和布鲁菌病在民间俗称“两病”,不仅是影响奶牛业发展的重要疫病,还给公共卫生也带来巨大威胁。随着“两病”控制及净化力度的不断加大,对两病的安全高效检测及监测手段也提出了更高的要求。奶样检测具有无应激、适合监测、降低成本等天然的优势;基于大缸奶样的检测方法作为群体监测的重要方法在国外很早就有应用,不仅用作常规的监测,还能够作为预警,对新发传染病的传入做出快速反应。我国基于大缸奶样的牛病检测刚刚起步,很多养殖企业或相关单位对该方法还不甚了解。本文从大缸奶样检测的优势、可行性及应用现状等方面进行了介绍,以期为基于大缸奶样检测的临床实践提供指导。

关键词：牛结核病牛布鲁菌病奶样检测

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一例育肥猪猪呼吸道疾病综合征的诊断

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黑龙江畜牧兽医 2020年第16期 57-59,64,165页

作者：牛伟杰孙琪于学祥库旭钢何启盖罗锐华中农业大学动物医学院武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 华中农业大学动物疫病诊断中心武汉430070

猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)是由多种病原及环境条件等多种因素引起的猪呼吸系统疾病。2019年4月份,湖北省某猪场育肥阶段猪只出现明显的呼吸道症状,且发病率高达60%,死亡率约为8%,造成了严重的经济... 详细信息

猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)是由多种病原及环境条件等多种因素引起的猪呼吸系统疾病。2019年4月份,湖北省某猪场育肥阶段猪只出现明显的呼吸道症状,且发病率高达60%,死亡率约为8%,造成了严重的经济损失。为了对该病进行诊断,试验采用剖检病变、实验室检测进行诊断,对分离菌进行药敏试验,并根据诊断结果进行防控。结果表明:根据病猪临床症状、剖检病变及实验室检测结果,最后确定该场PRDC是由细菌、病毒混合感染所致。推断可能是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV-2)混合感染引起免疫抑制后继发多杀性巴氏杆菌(Pm)和副猪嗜血杆菌(Hps)、猪链球菌(SS)感染所致。可采取改善饲养环境、药物治疗及对猪群进行群体保健等防控措施。说明猪场应重视PRDC的实验室诊断及防控。

关键词：猪呼吸道疾病综合征经济损失混合感染免疫抑制诊断防控

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猪源多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

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中国兽医科学 2015年第9期45卷 943-951页

作者：彭忠王庚吴广敬王豪男郭龙汤细彪吴斌陈焕春华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 华中农业大学动物医学院生猪健康养殖协同创新中心湖北武汉430070

2014年3月至2015年2月从来源于全国15个省份的180份临床猪肺组织样品中共分离到71株多杀性巴氏杆菌,分离率为39.4%。利用PCR技术对所分离的多杀性巴氏杆菌进行荚膜血清型鉴定,其中A型菌株41株（占57.8%）,D型菌株27株（占38.0%）,F型菌... 详细信息

2014年3月至2015年2月从来源于全国15个省份的180份临床猪肺组织样品中共分离到71株多杀性巴氏杆菌,分离率为39.4%。利用PCR技术对所分离的多杀性巴氏杆菌进行荚膜血清型鉴定,其中A型菌株41株（占57.8%）,D型菌株27株（占38.0%）,F型菌株3株（占4.2%）,71株多杀性巴氏杆菌中包括1株D型产毒素多杀性巴氏杆菌（占1.4%）,说明当前在我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌主要为A型和D型菌株。应用PCR检测多杀性巴氏杆菌23种毒力基因,结果显示：多杀性巴氏杆菌毒力基因的数量大多分布在15～19之间,平均携带个数为17.5个;23种毒力基因中,ptfA,fimA,hsf-2,sodA,sodC,ompA,ompH,oma87,plpB,exbB,tonB,Fur,hgbB的检出率在90%以上,而toxA基因的检出率极低（1.4%）,并且在猪源多杀性巴氏杆菌中未检测到t bpA的存在;分析毒力基因在不同血清型菌株中的携带及分布情况发现,A型的平均毒力基因携带数为18.2个,D型为16.4个;不同毒力基因在不同血清型的多杀性巴氏杆菌中的分布也存在一定的差异,其中唾液酸代谢酶基因nanB、透明质酸酶基因pmHAS及黏附基因tadD和pfhA在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率高于其在D型多杀性巴氏杆菌中的检出率（P〈0.01）;而黏附基因hsf-1在D型多杀性巴氏杆菌的检出率显著高于其在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率（P〈0.01）。对所分离菌株的16SrRNA基因进行测序,并与NCBI上公布的10株多杀性巴氏杆菌16S rRNA基因进行进化树分析,结果显示：71株多杀性巴氏杆菌主要分为2个亚群,亚群Ⅰ和HB03及3480的亲缘关系较近,而亚群Ⅱ则与HN06、Pm70、36950等菌株的亲缘关系较近;遗传进化的结果说明,多杀性巴氏杆菌的亲缘关系与其来源、血清型及其导致的疾病种类并没有表现出特定的亲缘关系。

关键词：多杀性巴氏杆菌分离鉴定荚膜血清型毒力基因 16SrRNA基因

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猪FcRn胞浆尾区的克隆表达及多克隆抗体制备

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中国兽医学报 2012年第2期32卷 262-266,271页

作者：崔惠娟洪素梅陈志虎毕丁仁李自力华中农业大学动物医学学院湖北武汉430070 农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

采用RT-PCR方法从猪肝脏总RNA中克隆猪FcRn基因,然后利用PCR技术亚克隆猪FcRn胞浆尾区(FcRn-CT),构建重组原核表达质粒KG-CT和pET32a-CT,分别在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,并利用Glutathione Sepharose 4B和HisTrap FF crude亲和层... 详细信息

采用RT-PCR方法从猪肝脏总RNA中克隆猪FcRn基因,然后利用PCR技术亚克隆猪FcRn胞浆尾区(FcRn-CT),构建重组原核表达质粒KG-CT和pET32a-CT,分别在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,并利用Glutathione Sepharose 4B和HisTrap FF crude亲和层析柱纯化目的蛋白。用纯化蛋白KG-CT免疫新西兰白兔,制备了多克隆抗体。利用纯化蛋白pET32a-CT建立了间接ELISA法,检测多抗效价达1∶32 000。Western blot检测结果表明该多抗特异性良好,为进一步研究FcRn在猪体内的表达分布及功能研究奠定了基础。

关键词：猪 FcRn胞浆尾区原核表达多克隆抗体

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PRRSV感染原代和传代PAM的比较转录组学分析

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中国兽医学报 2021年第11期41卷 2091-2100页

作者：周艳荣郝婉君卫莹李洋柯文婷肖少波方六荣华中农业大学动物医学学院农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是严重危害世界养猪业的重要病原。PRRSV对原代猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)和传代猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophage,IPAM)均易感,但在感染早期,PRRSV在IPAM中的感染率显著高于PAM。为了揭示这2种细胞在PRRSV感染后的应答差异,本研究运用Illumina高通量测序技术对PRRSV感染的IPAM和PAM进行转录组测序,结果表明,PRRSV感染PAM和IPAM后能够诱导相似的免疫应答,但PAM的免疫应答反应更强;与代谢相关的基因在PRRSV感染的IPAM中差异更显著。进一步分析发现,PRRSV感染IPAM后下调细胞周期相关基因的表达水平,导致细胞周期停滞在G0/M期,从而促进PRRSV增殖;IPAM抗原递呈相关基因的缺失或低丰度表达可能是IPAM中免疫应答水平较低的原因;Nod-like receptor(NLR)、Toll-like receptor(TLR)、Target of rapamycin(TOR)、adenosine 5'monophosphate-activated protein kinase(AMPK)和phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B(PI3K-Akt)等信号通路在PRRSV感染的PAM和IPAM中激活状态不同,可能导致了PRRSV在这2种细胞中的增殖差异。本研究结果为深入了解PRRSV感染原代和传代PAM后的应答差异补充了有用的数据。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒比较转录组学 PAM IPAM

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长链非编码RNA CTO-S对伪狂犬病毒复制的影响

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微生物学报 2022年第2期62卷 754-763页

作者：苏乐段龙川姜慧付雯李林涛陈焕春刘正飞华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北洪山实验室湖北武汉430070 温州科技职业学院动物科学学院浙江温州325000

【目的】研究伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)CTO-S对于病毒复制的影响。【方法】利用3′RACE和5′RACE鉴定CTO-S的全长序列。验证CTO-S是否具有编码多肽的能力。Red重组方法构建CTO-S... 详细信息

【目的】研究伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)CTO-S对于病毒复制的影响。【方法】利用3′RACE和5′RACE鉴定CTO-S的全长序列。验证CTO-S是否具有编码多肽的能力。Red重组方法构建CTO-S缺失株以及回复突变株。分析野毒株、缺失株和回复突变株复制的差异。利用RNA pull down联合质谱的方法筛选与CTO-S互作的宿主蛋白。利用RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)方法进行验证。最后利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测野毒株、缺失株和回复突变株对细胞凋亡的影响。【结果】CTO-S全长267 bp,不具有编码多肽的能力。CTO-S缺失不影响PRV的复制。CTO-S与泛醇细胞色素c还原酶的组成部分cytochrome b-c1 complex subunit 1互作,诱导细胞凋亡。【结论】CTO-S对于PRV的复制是非必需的,CTO-S与泛醇细胞色素c还原酶的组成部分cytochrome b-c1 complex subunit 1互作,诱导细胞凋亡。

关键词：伪狂犬病毒长链非编码RNA CTO-S 突变株复制互作

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梅花鹿γ-干扰素在不同真核细胞系中稳定表达的研究

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中国畜牧兽医 2010年第5期37卷 85-89页

作者：刘颖王冰于清龙熊家军杨利国陈焕春郭爱珍华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 华中农业大学动物医学院预防兽医学省重点实验室武汉430070 华中农业大学动物科技学院武汉430070

提取经植物血凝素诱导培养的梅花鹿外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出梅花鹿γ-干扰素成熟蛋白基因,经克隆测序表明与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到含有CMV增强子的真核表达载体质粒pCI-neo上。利用磷酸... 详细信息

提取经植物血凝素诱导培养的梅花鹿外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出梅花鹿γ-干扰素成熟蛋白基因,经克隆测序表明与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到含有CMV增强子的真核表达载体质粒pCI-neo上。利用磷酸钙介导转染法将重组载体质粒pCI-neo-CerIFN-γ转染入中国仓鼠肾细胞(BHK-21)和牛肾细胞(MDBK)中,在G418抗性压力下进行筛选培养获得了稳定分泌表达的转染细胞系。通过Western blotting检测确定表达产物的相对分子质量分别为23、20、16ku,与预测大小一致。本研究成果为进一步开发梅花鹿生物制品类治疗制剂奠定了基础。

关键词：梅花鹿 γ-干扰素细胞系真核表达

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检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用

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中国预防兽医学报 2006年第2期28卷 220-225页

作者：汪招雄何启盖刘丽娜刘正飞黄红亮陈焕春华中农业大学动物医学院预防兽医学湖北省重点实验室农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

以猪伪狂犬病病毒(PrV)Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体,纯化的抗PrVIgG为检测抗体,建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为,单克隆抗体576株的包被浓度为12.2μg/mL,IgG的工作浓度为16.0μg/mL,对PrV的检测灵敏... 详细信息

以猪伪狂犬病病毒(PrV)Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体,纯化的抗PrVIgG为检测抗体,建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为,单克隆抗体576株的包被浓度为12.2μg/mL,IgG的工作浓度为16.0μg/mL,对PrV的检测灵敏度达15.6ng(0.156μg/mL),与乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪流感病毒(SIV)等无交叉反应。批间和批内变异系数较小,分别为6.39%和4.1%。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测,肺和脑PrV抗原检出率最高,其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测,发现二者的符合率可达到77.4%,比PCR敏感。实验结果表明:双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点,可广泛应用于动物组织中PrV的检测。

关键词：双抗体夹心间接ELISA 单克隆抗体猪伪狂犬病毒Ea株

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IFN-γ-ELISpot方法用于评价猪伪狂犬病疫苗免疫效果

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畜牧兽医学报 2017年第10期48卷 1939-1948页

作者：谭鑫库旭钢于学祥郭恒科何东贤范盛先何启盖华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 华中农业大学动物医学院武汉430070 生猪健康养殖协同创新中心武汉430070

鉴于常用的抗体检测方法不能完整反映免疫猪获得针对猪伪狂犬病毒的保护力,有必要建立猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性IFN-γ的酶联免疫斑点检测(ELISpot)方法,并评估伪狂犬病疫苗细胞免疫的免疫效果。依照ELISpot基本操作流程,摸索PRV作为... 详细信息

鉴于常用的抗体检测方法不能完整反映免疫猪获得针对猪伪狂犬病毒的保护力,有必要建立猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性IFN-γ的酶联免疫斑点检测(ELISpot)方法,并评估伪狂犬病疫苗细胞免疫的免疫效果。依照ELISpot基本操作流程,摸索PRV作为刺激原的最适浓度、外周血单个核细胞(PBMC)密度和作用时间以建立并优化该方法。将20头gB抗体检测阴性猪,随机分为单独弱毒疫苗免疫组、单独灭活疫苗免疫组、弱毒疫苗-灭活疫苗联合组及对照组,免疫后攻毒。利用所建方法,结合gB-ELISA、中和试验及攻毒保护试验,评价上述三种免疫程序的效果。试验结果表明:IFN-γ-ELISpot最佳条件为刺激原浓度2μg·孔^(-1)、外周血单核细胞(PBMC)浓度106·孔^(-1),培养时间36h。一免弱毒疫苗二免灭活疫苗组二免后2周,试验猪中和抗体效价可达1∶14.48,ELISpot斑点数可达(151.8±26.61)个·孔^(-1),且该免疫程序下,试验猪攻毒后体温、鼻拭子排毒及临床症状均低于其余试验组,攻毒8d后仅表现呼吸道症状;单独灭活疫苗免疫组二免后2周,试验猪的中和抗体效价可达1∶32.36,而ELISpot斑点数仅为(40.4±9.07)个·孔^(-1);单独弱毒疫苗免疫组二免后2周,试验猪的中和抗体效价仅为1∶1.36,但ELISpot斑点数可达(189.6±27.36)个·孔^(-1)。综合分析攻毒试验结果和ELISpot斑点数之间的相关性,本试验所建立的IFN-γ-ELISpot可用于猪伪狂犬病疫苗的细胞免疫评估,为免疫程序的评价和选择提供有效手段。

关键词：猪伪狂犬病 IFN-γ-ELISpot 细胞免疫疫苗免疫程序

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ASFV、CSFV、PRRSV多重荧光PCR检测方法的建立与应用

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中国兽医学报 2021年第11期41卷 2107-2113页

作者：牛伟杰于学祥高宇库旭钢何启盖罗锐华中农业大学动物医学学院湖北武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 华中农业大学动物疫病诊断中心湖北武汉430070

非洲猪瘟病毒(ASFV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前影响猪群和我国养殖业的重要的3种病原,且3种疾病临床表现相似,因此,建立一种可以快速检测、区分3种病原的方法十分必要。本研究依据ASFV、CSFV、PRRSV的... 详细信息

非洲猪瘟病毒(ASFV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前影响猪群和我国养殖业的重要的3种病原,且3种疾病临床表现相似,因此,建立一种可以快速检测、区分3种病原的方法十分必要。本研究依据ASFV、CSFV、PRRSV的基因保守片段设计特异性引物和探针,建立了多重荧光PCR检测方法。结果显示,所建立的多重荧光PCR可同时检测ASFV、CSFV、PRRSV 3种病原,特异性好、灵敏度高,对3种病原的检测下限分别达到13,16,26个拷贝;重复性良好,组内及组间重复试验的变异系数(CV)均在2%以内。将ASFV OIE标准、CSFV、PRRSV国家标准荧光qPCR作为金标准,同时对180份样品进行检测对比,结果显示,本研究方法对CSFV灵敏性和特异性分别为94.59%和100.00%,总符合率为98.89%;对PRRSV灵敏性为92.68%,特异性为98.56%,总符合率为97.22%;未检测到ASFV。使用所建立的方法对839份临床样品进行检测,结果显示,CSFV、PRRSV是当前猪群疾病的主要病原,且育肥阶段猪只CSFV、PRRSV核酸检出率均显著高于保育阶段猪只(P<0.01)。结果表明,本研究所建立的方法具有较高的灵敏性和特异性,可用于临床样品检测,猪场在防控非洲猪瘟的同时也须加强对CSF、PRRS的防控工作。

关键词：多重荧光定量PCR 鉴别诊断非洲猪瘟经典猪瘟猪繁殖与呼吸综合征

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