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微生物学报 2022年第2期62卷 754-763页

作者：苏乐段龙川姜慧付雯李林涛陈焕春刘正飞华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北洪山实验室湖北武汉430070 温州科技职业学院动物科学学院浙江温州325000

【目的】研究伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)CTO-S对于病毒复制的影响。【方法】利用3′RACE和5′RACE鉴定CTO-S的全长序列。验证CTO-S是否具有编码多肽的能力。Red重组方法构建CTO-S... 详细信息

【目的】研究伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)CTO-S对于病毒复制的影响。【方法】利用3′RACE和5′RACE鉴定CTO-S的全长序列。验证CTO-S是否具有编码多肽的能力。Red重组方法构建CTO-S缺失株以及回复突变株。分析野毒株、缺失株和回复突变株复制的差异。利用RNA pull down联合质谱的方法筛选与CTO-S互作的宿主蛋白。利用RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)方法进行验证。最后利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测野毒株、缺失株和回复突变株对细胞凋亡的影响。【结果】CTO-S全长267 bp,不具有编码多肽的能力。CTO-S缺失不影响PRV的复制。CTO-S与泛醇细胞色素c还原酶的组成部分cytochrome b-c1 complex subunit 1互作,诱导细胞凋亡。【结论】CTO-S对于PRV的复制是非必需的,CTO-S与泛醇细胞色素c还原酶的组成部分cytochrome b-c1 complex subunit 1互作,诱导细胞凋亡。

关键词：伪狂犬病毒长链非编码RNA CTO-S 突变株复制互作

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3株鸭疫里氏杆菌的分离鉴定与药敏试验

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中国畜牧兽医 2023年第3期50卷 1250-1258页

作者：陈栋张言浩张阳李森周祖涛李自力华中农业大学动物医学院预防兽医学系武汉430070 湖北省预防兽医学重点实验室武汉430070 农业微生物学国家重点实验室武汉430070

【目的】了解湖北地区鸭疫里氏杆菌病的分布流行与耐药情况,为该地区肉鸭养殖场鸭疫里氏杆菌病的临床用药提供参考。【方法】对武汉周边区县(江夏区、黄陂区、黄梅县)肉鸭养殖场的鸭疫里氏杆菌疑似病例进行采样并分离病原菌,对分离菌的... 详细信息

【目的】了解湖北地区鸭疫里氏杆菌病的分布流行与耐药情况,为该地区肉鸭养殖场鸭疫里氏杆菌病的临床用药提供参考。【方法】对武汉周边区县(江夏区、黄陂区、黄梅县)肉鸭养殖场的鸭疫里氏杆菌疑似病例进行采样并分离病原菌,对分离菌的形态学、染色特性、生化特性、16S rRNA进行鉴定,并对鉴定为鸭疫里氏杆菌的分离株进行血清型和耐药性分析。利用标志基因整合酶的特异性引物PCR鉴定分离菌基因组,判断是否整合有50K基因岛。【结果】分离鉴定了3株鸭疫里氏杆菌,3株分离菌均能在TSA平皿培养基中生长为光滑的半透明状菌落,革兰氏染色为阴性、瑞氏染色可观察到两极浓染;生化试验结果显示,3株鸭疫里氏杆菌均不发酵多种糖类,过氧化氢酶阳性,不产硫化氢,不能液化明胶。16S rRNA鉴定结果显示,获得大小为1480 bp的目的条带,血清型均为1型;50K基因岛标志基因PCR扩增结果显示,仅黄梅分离株(HM株)含有该基因岛。最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)试验与纸片扩散(Kirby-Bauer,K-B)试验测定耐药性结果显示,3株分离菌株均对青霉素、阿莫西林、头孢曲松、头孢噻肟、氟苯尼考及庆大霉素敏感,对萘啶酮酸、壮观霉素、恩诺沙星、多黏菌素B表现出不同程度的耐药性。【结论】分离鉴定了3株血清1型鸭疫里氏杆菌,药敏试验结果对本地区鸭疫里氏杆菌病的防治及流行病学研究提供一定的理论指导。

关键词：鸭疫里氏杆菌分离鉴定血清型 50K基因岛药物敏感性

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猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

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中国动物传染病学报 2023年第6期31卷 1-10页

作者：方谱县张蕙畅夏思进江晓翠孙倩倩肖少波方六荣华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070 湖北省生猪健康养殖协同创新中心武汉430070

为制备猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于临床样品中PDCoV抗原的免疫组织化学(IHC)检测,本研究以原核表达的PDCo V N蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,基于纯化的N蛋白建立的间接ELISA方法筛... 详细信息

为制备猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于临床样品中PDCoV抗原的免疫组织化学(IHC)检测,本研究以原核表达的PDCo V N蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,基于纯化的N蛋白建立的间接ELISA方法筛选获得稳定分泌N蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体的免疫反应特异性、亚类进行系统鉴定。结果显示:通过3次亚克隆筛选获得8株可分泌PDCo V N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA和Western blot分析,证实制备的单克隆抗体均与猪δ冠状病毒反应,且不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)反应,特异性良好。单克隆抗体亚类鉴定结果表明,1A11、3C6、1E7、1E12株单克隆抗体属Ig G1型,4F3、2A3株单克隆抗体为Ig G2a型,3E4单克隆抗体为Ig M型,8株单克隆抗体的轻链均为κ链。利用1A11单克隆抗体对PDCo V、PDEV、TGEV感染猪的空肠、回肠组织进行IHC检测,结果表明1A11能与感染PDCo V的组织发生特异性免疫反应,而不与感染PDEV和TGEV的组织发生反应,特异性良好。本研究制备的PDCo V N蛋白单克隆抗体可为PDCo V诊断方法的建立以及N蛋白的功能研究奠定基础。

关键词：猪δ冠状病毒 N蛋白原核表达系统单克隆抗体免疫组化

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猪δ冠状病毒辅助蛋白研究进展

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中国动物传染病学报 2023年第1期31卷 213-221页

作者：张蕙畅方谱县方六荣肖少波华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070 湖北省生猪健康养殖协同创新中心武汉430070

猪δ冠状病毒(PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,可引起新生仔猪的腹泻、呕吐、脱水、死亡,而且具有跨种感染潜能,给养猪业和公共卫生构成了巨大威胁。冠状病毒的辅助蛋白(accessory protein)是一类功能特殊的蛋白,不同属甚至同属不... 详细信息

猪δ冠状病毒(PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,可引起新生仔猪的腹泻、呕吐、脱水、死亡,而且具有跨种感染潜能,给养猪业和公共卫生构成了巨大威胁。冠状病毒的辅助蛋白(accessory protein)是一类功能特殊的蛋白,不同属甚至同属不同种的冠状病毒编码的辅助蛋白数量、同源性均存在较大差异,具有属或种特异性。虽然辅助蛋白是冠状病毒增殖非必需的,但在调控宿主天然免疫、病毒复制与致病性中发挥重要作用。目前,已证实PDCoV至少编码3个辅助蛋白,而且近年来在PDCoV辅助蛋白的功能研究方面取得了显著进展。本文简要介绍了PDCoV辅助蛋白的鉴定及其在免疫调控和致病性中的作用,并对今后的研究进行了展望。

关键词：猪δ冠状病毒辅助蛋白感染免疫抑制致病性

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2021年我国饲料原料中常见霉菌毒素污染情况调查

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中国家禽 2023年第10期45卷 70-75页

作者：刘建高厉学武彭哲孙铝辉赵玲华中农业大学动物科技学院、动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北洪山实验室湖北武汉430070 新希望六和股份有限公司北京100102

为调查2021年我国各省饲料原料中黄曲霉毒素B1(AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的污染情况,试验分别对从中国不同地区采集的3166、3335和1407个饲料原料样品进行AFB1、DON和ZEN含量检测。结果显示,样品中AFB1、DON和... 详细信息

为调查2021年我国各省饲料原料中黄曲霉毒素B1(AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的污染情况,试验分别对从中国不同地区采集的3166、3335和1407个饲料原料样品进行AFB1、DON和ZEN含量检测。结果显示,样品中AFB1、DON和ZEN总污染率分别为79.2%、90.0%和82.2%,分别有6.8%、2.3%和12.2%的样品中AFB1、DON和ZEN浓度超过我国饲料卫生标准。值得注意的是,AFB1在花生粕和菜籽粕中的污染率为100%,其中花生粕中AFB1的超标率高达19.6%;DON在玉米胚芽粕中的超标率为24.0%,ZEN在玉米胚芽粕和玉米蛋白粉中的超标率分别高达56.3%和60.0%。研究表明,在2021年期间,我国饲料原料普遍受到AFB1、DON和ZEN的污染,其中花生粕的AFB1污染情况较为严重,玉米胚芽粕的DON和ZEN污染情况均较为严重,应在霉菌毒素防控中重点关注。

关键词：饲料原料黄曲霉毒素B1 呕吐毒素玉米赤霉烯酮污染情况

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2019-2020年湖北部分地区G9P型人轮状病毒基因特征

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中国人兽共患病学报 2022年第4期38卷 359-365页

作者：杨立君陈月米文琴唐一通范久波王媛廖诗英陈焕春何启盖江云波华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070 湖北文理学院医学部武汉430070

目的对人A组轮状病毒进行检测及分离鉴定,并研究其各基因片段的遗传进化关系。方法2019-2020年对湖北武汉市和襄阳市临床腹泻病人的粪便样品进行采集,共319份。设计特异性轮状病毒VP6基因引物,RT-PCR检测轮状病毒的感染情况。将阳性样... 详细信息

目的对人A组轮状病毒进行检测及分离鉴定,并研究其各基因片段的遗传进化关系。方法2019-2020年对湖北武汉市和襄阳市临床腹泻病人的粪便样品进行采集,共319份。设计特异性轮状病毒VP6基因引物,RT-PCR检测轮状病毒的感染情况。将阳性样品接种于MA104细胞进行轮状病毒的分离。RT-PCR特异性扩增VP6基因和特异性间接免疫荧光对其进行病毒鉴定及病毒增殖检测;并进一步通过RT-PCR扩增轮状病毒的11个基因片段,在线工具Rota C V2.0对测序结果进行分型分析。Mega软件对其全基因组序列进行遗传进化分析。结果轮状病毒感染阳性标本共69份,阳性率为21.63%。成功分离获得11株人轮状病毒,主要衣壳蛋白VP7和VP4基因型均为G9P[8]型。其中3株轮状病毒归属于类Wa株毒株,基因型图谱为G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1。8株毒株在Wa-like的基因型中具有DS-1-like的NSP4为E2基因型特征。基因型图谱为G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E2-H1。结论G9P[8]型人轮状病毒毒株在2019-2020年湖北部分地区占主导趋势,且其NSP4基因以E2基因型为主要流行形式。

关键词：轮状病毒分离鉴定基因型遗传进化分析

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屎肠球菌对感染柔嫩艾美耳球虫肉鸡生长性能和肠道屏障的影响

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畜牧兽医学报 2022年第4期53卷 1210-1219页

作者：焦宇洲杨欢欢卢垚史聪聪徐晓娟蔡旭旺华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070 武汉科缘生物发展有限责任公司武汉430206

旨在探究屎肠球菌(Enterococcus faecium)对人工感染柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)肉鸡生长性能、存活率、盲肠损伤、粪便卵囊排出和肠道屏障功能的影响。选取体重相近的1日龄肉鸡(罗斯308)180羽,随机分为5组,包括空白对照组(NC)、... 详细信息

旨在探究屎肠球菌(Enterococcus faecium)对人工感染柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)肉鸡生长性能、存活率、盲肠损伤、粪便卵囊排出和肠道屏障功能的影响。选取体重相近的1日龄肉鸡(罗斯308)180羽,随机分为5组,包括空白对照组(NC)、感染对照组(PC)、70 mg·kg^(-1)盐霉素添加组(SAL)、*** 1.0×10^(8) CFU·kg^(-1)添加组(EA)和*** 2.5×10^(9)CFU·kg^(-1)添加组(EB)。NC和PC组饲喂基础饲粮,SAL、EA、EB组在分组后即开始饲喂添加盐霉素和***的饲粮,持续至试验结束。在15 d时,除NC组外所有试验组的鸡均口服感染1.0×10^(5)个***孢子化卵囊。通过分析平均日增重(ADG)、克粪便卵囊数(OPG)、盲肠损伤评分、组织病理学检查和盲肠屏障相关分子(iNOS、MUC2、Occludin、JAM2、ZO-1)的基因表达量来评价***的抗球虫效果。结果表明:1)相比于NC组,EA和EB组可以显著增加感染前ADG(P<0.05),并且感染后SAL和EB组ADG显著高于PC组(P<0.05);2)SAL、EA和EB组粪便中的卵囊数显著低于PC组(P<0.05),PC组可以观察到明显的病理损伤、炎性细胞浸润和肠绒毛断裂,而预防组(SAL、EA、EB)病变较轻微,但是所有感染组盲肠损伤评分并没有差异(P>0.05);3)在整个试验期间各组存活率分别为100%(NC)、58.33%(PC)、83.33%(SAL)、58.33%(EA)、75.00%(EB);4)相比于NC组,PC组肠道iNOS、MUC2、Occludin、JAM2和ZO-1的表达均显著下降(P<0.05),而SAL、EA、EB组均能显著提高iNOS的表达量(P<0.05);EB组肠道MUC2、Occludin和JAM2的表达量也显著高于PC组(P<0.05)。综上所述,***具有一定的抗球虫效果,可能通过调节肠道屏障相关分子的表达发挥作用。

关键词：屎肠球菌柔嫩艾美耳球虫肠道屏障

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益生菌调控肠道屏障功能预防家禽球虫病的研究进展

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微生物学报 2021年第5期61卷 1064-1072页

作者：焦宇洲于江旭高东阳王颢然蔡旭旺华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

球虫病给养禽业带来巨大经济损失,人们对绿色健康食品的迫切需求使球虫病的防控面临新的挑战。伴随世界“禁抗”进程的不断推进,家禽养殖业亟需一种安全有效的新型抗球虫方法。益生菌可竞争性排斥病原菌定殖以防止球虫病继发感染,可刺... 详细信息

球虫病给养禽业带来巨大经济损失,人们对绿色健康食品的迫切需求使球虫病的防控面临新的挑战。伴随世界“禁抗”进程的不断推进,家禽养殖业亟需一种安全有效的新型抗球虫方法。益生菌可竞争性排斥病原菌定殖以防止球虫病继发感染,可刺激宿主抗菌肽、黏蛋白和紧密连接蛋白的分泌以抵御球虫入侵,还可激活免疫反应以增强机体抗球虫感染的能力。本文从调控肠道微生物群、改善肠黏膜屏障和调节免疫系统功能等方面综述了益生菌在预防和控制家禽球虫病中的作用,以期为高效抗球虫益生菌制剂的研发提供参考。

关键词：球虫病益生菌肠道屏障

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1种植物瞬时表达捻转血矛线虫氨基肽酶基因和Hc23基因方法的建立

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中国兽医学报 2022年第12期42卷 2420-2426页

作者：叶莉莎张挺廖聪李婷婷田振东胡敏华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 华中农业大学农业农村部马铃薯生物学与生物技术重点实验室湖北武汉430070

为建立利用植物细胞瞬时表达反刍动物寄生线虫捻转血矛线虫优势抗原的方法,选取了氨基肽酶基因Hc-ap-10和优选抗原分子基因Hc23作为目标基因,将经过密码子优化的Hc-ap-10(AP10^(op))和Hc23分别插入pH7lic-EGFP表达载体并在N、C两端均添... 详细信息

为建立利用植物细胞瞬时表达反刍动物寄生线虫捻转血矛线虫优势抗原的方法,选取了氨基肽酶基因Hc-ap-10和优选抗原分子基因Hc23作为目标基因,将经过密码子优化的Hc-ap-10(AP10^(op))和Hc23分别插入pH7lic-EGFP表达载体并在N、C两端均添加核定位信号(nuclear localization sequence,NLS),使用电转法将pH7dNLSAP10^(op)和pH7dNLSHc23分别转入GV3101根癌农杆菌中,随后将根癌农杆菌悬液侵染本氏烟草,最后通过荧光显微镜观察目标蛋白定位情况,并提取侵染烟草叶片总蛋白,使用Western blot检测蛋白的表达量。结果显示,成功构建了植物双元表达载体pH7dNLSAP10^(op)和pH7dNLSHc23,荧光显微镜观察发现在目的基因N、C两端添加了核定位信号后的质粒转化根癌农杆菌。该方法外源表达的膜蛋白pH7dNLSAP10^(op)和pH7dNLSHc23都成功表达在本氏烟草叶片的细胞核上,Western blot也成功检测到Hc23和AP10^(op)蛋白,且Hc23蛋白的表达水平相对较高。结果表明,添加了核定位信号能成功将目的蛋白表达在植物细胞核上;密码子优化有利于大分子蛋白的高效表达,但对于一些相对分子质量相对较小的蛋白可能是非必要的。该研究成功将2种抗原分子表达在植物细胞中,为后续疫苗的研究奠定了基础。

关键词：瞬时表达捻转血矛线虫氨基肽酶 Hc23基因核定位信号根癌农杆菌本氏烟草

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羊弓形虫病间接ELISA诊断方法的建立

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中国动物传染病学报 2022年第1期30卷 127-133页

作者：李迎迎侯伦王敏李亚琼李明俊周艳琴赵俊龙申邦华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070 湖北省预防兽医学重点实验室武汉430070

为比较5种弓形虫抗原的诊断效果,建立实用的羊弓形虫病诊断方法,本研究制备了弓形虫速殖子全虫抗原和4个重组蛋白(GRA1、MIC3、MAG、BAG1),正交试验比较其免疫反应性,从中筛选出相对优势抗原并建立羊弓形虫病间接ELISA(iELISA)诊断方法... 详细信息

为比较5种弓形虫抗原的诊断效果,建立实用的羊弓形虫病诊断方法,本研究制备了弓形虫速殖子全虫抗原和4个重组蛋白(GRA1、MIC3、MAG、BAG1),正交试验比较其免疫反应性,从中筛选出相对优势抗原并建立羊弓形虫病间接ELISA(iELISA)诊断方法,用于检测弓形虫特异的IgG抗体。研究结果表明:除BAG1外上述4种抗原均具有较好的免疫反应性,综合考虑选择致密颗粒蛋白1(GRA1)作为诊断抗原建立了GRA1-iELISA,其检测弓形虫抗体灵敏度大于1∶100(血清稀释度),且不与羊莫氏巴贝斯虫、吕氏泰勒虫、捻转血毛线虫阳性血清发生交叉反应,特异性良好;运用建立的方法和改良凝集试验分别对采自山羊屠宰场的80份血清样品进行检测,测得的弓形虫感染阳性率分别为28.75%(23/80)和31.25%(25/80),二者总符合率为82.5%。本研究建立的ELISA检测方法对羊弓形虫病的诊断以及商业化试剂盒的开发具有重要参考价值。

关键词：羊弓形虫病 GRA1 间接ELISA

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