检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医学报 2009年第10期29卷 1286-1289页

作者：张克山向敏吴斌徐卓菲蔡利军王勤刚陈焕春华中农业大学动物医学院动物传染病实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

根据GenBank公布的序列设计1对引物扩增O型口蹄疫病毒P12A3C基因并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV内。含有目的基因的穿梭质粒(pShuttle-PAC)线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细菌。利用细菌内... 详细信息

根据GenBank公布的序列设计1对引物扩增O型口蹄疫病毒P12A3C基因并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV内。含有目的基因的穿梭质粒(pShuttle-PAC)线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细菌。利用细菌内同源重组法得到重组腺病毒质粒(pAd-PAC)。在Lipofectamine 2000介导下重组腺病毒质粒转染HEK293细胞得到重组腺病毒(Ad-PAC)。半数组织培养感染剂量(TCID50)测定、免疫荧光试验(IFA)和连续传代后目的基因的PCR扩增,证实重组病毒滴度为105.5TCID50/0.1 mL,重组病毒HEK293细胞中得以表达且遗传稳定性良好;动物试验表明,该重组病毒能够诱导小鼠产生较高水平的针对口蹄疫病毒的特异性抗体;本试验为口蹄疫重组腺病毒活载体疫苗的进一步研究和应用奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒腺病毒重组病毒免疫原性

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亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒双拷贝VP1基因的串联表达及其免疫原性

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畜牧兽医学报 2009年第3期40卷 383-387页

作者：张克山向敏吴斌王勤刚陈焕春华中农业大学动物医学院动物病毒实验室武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因含有T细胞和B细胞表位,是口蹄疫病毒的主要免疫原性基因。作者将亚洲Ⅰ型FMDV VP1基因首尾串联构建双拷贝的VP1基因(2VP1),实现双拷贝VP1基因的原核表达,表达的重组蛋白(GST2VP1)经Sephadex-G200分子筛层析纯化... 详细信息

口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因含有T细胞和B细胞表位,是口蹄疫病毒的主要免疫原性基因。作者将亚洲Ⅰ型FMDV VP1基因首尾串联构建双拷贝的VP1基因(2VP1),实现双拷贝VP1基因的原核表达,表达的重组蛋白(GST2VP1)经Sephadex-G200分子筛层析纯化后,Western blot证实其有反应原性,动物试验表明重组蛋白在加强免疫后能够产生和灭活疫苗相当的ELISA抗体和中和抗体;本试验结果为亚洲Ⅰ型FMDV免疫原性研究及GST2VP1蛋白的进一步应用奠定了基础。

关键词：亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒 2VP1 串联表达免疫原性

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应用反向斑点杂交技术从转录序列的选择性捕获中筛选副猪嗜血杆菌表达差异基因

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农业生物技术学报 2009年第2期17卷 189-194页

作者：胡军勇金卉谢启运万云楚杰刘翠云陈焕春周锐华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室

通过对靶DNA的种类和浓度、探针浓度、紫外交联时间等反向斑点杂交条件优化,建立了一种从选择性捕获的转录序列(selective capture of transcribed sequences,SCOTS)库中筛选副猪嗜血杆菌在体内、外差异表达的基因的方法。通过反向斑点... 详细信息

通过对靶DNA的种类和浓度、探针浓度、紫外交联时间等反向斑点杂交条件优化,建立了一种从选择性捕获的转录序列(selective capture of transcribed sequences,SCOTS)库中筛选副猪嗜血杆菌在体内、外差异表达的基因的方法。通过反向斑点杂交技术从10个样品中筛选出的6个样品被证明是副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)在体内上调表达或者是特异表达的基因。结果表明:SCOTS技术能够有效地获得一个可能存在差异表达基因的cDNA文库,而反向斑点杂交技术可以有效地从中筛选到差异表达基因。

关键词：副猪嗜血杆菌差异表达基因转录序列的选择性捕获反向斑点杂交

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中国部分地区猪圆环病毒2型的基因型分析

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畜牧兽医学报 2009年第9期40卷 1358-1362页

作者：李文洁李文涛严伟东陈焕春何启盖华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070

对中国11个省(市)部分猪场收集的812份病料,应用ORF2-PCR进行检测,发现有235份为PCV2阳性病料。利用鉴别PCR方法从235份阳性病料中,检出10份PCV2a基因型和133份PCV2b基因型,检出率分别为4.2%、56.6%。进一步对ORF2-PCR检测阳性的部分模... 详细信息

对中国11个省(市)部分猪场收集的812份病料,应用ORF2-PCR进行检测,发现有235份为PCV2阳性病料。利用鉴别PCR方法从235份阳性病料中,检出10份PCV2a基因型和133份PCV2b基因型,检出率分别为4.2%、56.6%。进一步对ORF2-PCR检测阳性的部分模板进行全基因组扩增,构建阳性重组质粒,对插入质粒的片段进行测序鉴定,利用DNAStar进行同源性分析,同GenBank参考毒株绘制系统发育树,从系统发育树中也可分出PCV2a、PCV2b 2种基因型。鉴别PCR和测序结果说明,我国部分地区流行的猪圆环病毒2型以PCV2b基因型为主,少数为PCV2a基因型,也有既非PCV2a又非PCV2b的基因型(PCV2c?)。

关键词：猪圆环病毒2型分子流行病学 PCV2a PCV2b

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乙型脑炎病毒E基因自杀性DNA疫苗的构建及其免疫应答

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中国兽医科学 2009年第2期39卷 130-134页

作者：刘学芹李么明曹胜波叶静孙敏轩肖少波陈焕春华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 华中农业大学动物医学院湖北武汉430070

为探讨自杀性DNA疫苗在乙型脑炎疫苗开发中的可能性,将乙型脑炎病毒(JEV)E基因片段插入到自杀性DNA疫苗载体pSCA1(pS)中,构建了表达E基因的自杀性DNA疫苗质粒pSE。间接免疫荧光试验结果证实,该质粒转染BHK-21细胞后实现了E基因在细胞中... 详细信息

为探讨自杀性DNA疫苗在乙型脑炎疫苗开发中的可能性,将乙型脑炎病毒(JEV)E基因片段插入到自杀性DNA疫苗载体pSCA1(pS)中,构建了表达E基因的自杀性DNA疫苗质粒pSE。间接免疫荧光试验结果证实,该质粒转染BHK-21细胞后实现了E基因在细胞中的表达。将该疫苗和常规DNA疫苗(pCDE)分别免疫试验小鼠,进行体液免疫和细胞免疫检测。结果表明,在诱导体液免疫方面,pCDE要优于pSE,但pSE却可以诱导更强的细胞免疫反应,这为进一步评价该疫苗的免疫保护效果奠定了基础。

关键词：乙型脑炎病毒自杀性DNA疫苗免疫

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伪狂犬病毒Ea株UL38基因的克隆、序列分析及表达

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中国兽医学报 2009年第2期29卷 178-181,186页

作者：薛念波方六荣江云波俞明敏李彬罗锐陈焕春肖少波华中农业大学动物医学院动物病毒室湖北武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL38全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定。序列分析显示UL38基因全长1 107 bp,可编码369个氨基酸。将该基因克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下游... 详细信息

以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL38全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定。序列分析显示UL38基因全长1 107 bp,可编码369个氨基酸。将该基因克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下游,获得原核表达质粒pQE-UL38,IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达并获得相对分子质量约40 000的融合表达蛋白6×His-UL38,Western blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。进一步将UL38基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL38,转染Hela细胞,24、48 h通过激光共聚焦显微镜观察显示pEGFP-UL38,24 h荧光主要分布在胞浆,有部分分布在核内,但随时间延长,荧光逐渐向细胞核中转移,在转染后48 h几乎完全定位于核内。但对照载体pEGFP-N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞。

关键词：伪狂犬病毒 UL-38基因序列分析表达

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重组蛋白H-NS对胸膜肺炎放线杆菌生物被膜形成的影响

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农业生物技术学报 2009年第3期17卷 381-385页

作者：达来宝力格金卉刘璨颖陈焕春周锐华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室

在筛选胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)转座突变体库时,发现hns基因缺失突变可显著增强APP血清1型生物被膜的形成,该基因编码一种DNA结合蛋白(组蛋白样类核结构蛋白,H-NS)。为了进一步研究H-NS对APP生物被膜形... 详细信息

在筛选胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)转座突变体库时,发现hns基因缺失突变可显著增强APP血清1型生物被膜的形成,该基因编码一种DNA结合蛋白(组蛋白样类核结构蛋白,H-NS)。为了进一步研究H-NS对APP生物被膜形成的影响,实验以APP血清1型4074株基因组DNA为模板,PCR扩增了408bp的hns基因编码区,并克隆到原核表达载体pET-28c中获得重组质粒pET28c-hns,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导表达和组氨酸亲和层析柱纯化获得大小约19kD的重组蛋白rH-NS。将不同浓度的rH-NS添加到hns突变株1-21及其亲本菌株4074的培养基中,用微孔板法测定生物被膜的形成。结果显示,在不添加rH-NS时,4074株不能形成可见的生物被膜,而1-21株形成明显的生物被膜;在添加0.1～0.3μmol/LrH-NS的情况下,1-21株生物被膜的形成量随着rH-NS浓度的升高而降低,而4074株随着rH-NS浓度的升高而升高;rH-NS添加量超过0.4μmol/L对两个菌株生物被膜形成未见明显影响。结果表明H-NS蛋白负调控APP生物被膜的形成,并呈现一定的剂量效应。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌重组组蛋白样类核结构蛋白(H-NS) 生物被膜形成

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检测牛血吸虫病的重组LHD-Sj23蛋白乳胶凝集试验的建立

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湖北农业科学 2009年第9期48卷 2061-2065页

作者：赵清兰李友聂浩赵俊龙华中农业大学动物医学院武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

利用原核表达的日本血吸虫重组LHD-Sj23蛋白作为抗原致敏乳胶,建立诊断牛血吸虫病的乳胶凝集试验(LAT)。用制备的乳胶抗原分别检测牛结核杆菌、牛泰勒虫、牛巴贝斯虫、牛口蹄疫、牛边虫、牛传染性支气管炎阳性血清,结果均为阴性,说明建... 详细信息

利用原核表达的日本血吸虫重组LHD-Sj23蛋白作为抗原致敏乳胶,建立诊断牛血吸虫病的乳胶凝集试验(LAT)。用制备的乳胶抗原分别检测牛结核杆菌、牛泰勒虫、牛巴贝斯虫、牛口蹄疫、牛边虫、牛传染性支气管炎阳性血清,结果均为阴性,说明建立的乳胶凝集方法具有良好的特异性。用所建立的LAT方法与ELISA方法同时检测169份牛血清,结果表明,建立的LAT方法的特异性为94.29%,敏感性为93.10%,两种方法的符合率为94.08%(P>0.05),差异不显著。用同一批乳胶抗原检测7份牛血清,5次检测结果一致,说明致敏的乳胶抗原是稳定的。保存期试验结果表明,致敏乳胶在25℃可保存1个月,在4℃可保存3个月。这表明建立的LAT方法稳定、特异性强、灵敏度高、操作简便快速,无需昂贵仪器,适宜在临床上推广应用。

关键词：牛血吸虫病重组LHD-Sj23蛋白乳胶凝集试验诊断

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胸膜肺炎放线杆菌地方分离株和参考菌株的生物被膜形成

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中国兽医学报 2009年第11期29卷 1411-1414,1428页

作者：达来宝力格谢启运刘璨颖陈焕春周锐华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

通过玻璃试管和聚苯乙烯微孔板结晶紫染色法分别对胸膜肺炎放线杆菌(APP)的15个血清型国际参考菌株和22个中国地方分离菌株在体外形成生物被膜的能力进行了定性和定量分析。在15个血清型(无14型)的参考菌株中,只有5b、6和11型能在聚苯... 详细信息

通过玻璃试管和聚苯乙烯微孔板结晶紫染色法分别对胸膜肺炎放线杆菌(APP)的15个血清型国际参考菌株和22个中国地方分离菌株在体外形成生物被膜的能力进行了定性和定量分析。在15个血清型(无14型)的参考菌株中,只有5b、6和11型能在聚苯乙烯微孔板上形成生物被膜;而59%的地方分离株(涵盖13种血清型,无14和15型)在聚苯乙烯微孔板上表现出产生生物被膜的能力。结果表明,大多数血清型的APP能在体外形成生物被膜,尤其在地方分离株中更普遍;与低毒力血清型的菌株相比,高毒力和中等毒力血清型的菌株更倾向于形成生物被膜。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌生物被膜血清型毒力

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猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株的生物学特性及作为活疫苗表达载体的应用

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生物工程学报 2009年第1期25卷 29-36页

作者：赵战勤徐引弟吴斌程相朝李银聚汤细彪张春杰陈焕春河南科技大学动物科技学院动物病原微生物学实验室洛阳471003 华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070

为了评价猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株作为沙门氏菌Asd+平衡表达系统的可行性,对ΔasdC500株和其亲本菌株C500的生物表型、生长特性、毒力、生物安全性、表达特性等进行比较研究。结果表明:ΔasdC500缺失株的生化特性和血清型与亲本菌株C... 详细信息

为了评价猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株作为沙门氏菌Asd+平衡表达系统的可行性,对ΔasdC500株和其亲本菌株C500的生物表型、生长特性、毒力、生物安全性、表达特性等进行比较研究。结果表明:ΔasdC500缺失株的生化特性和血清型与亲本菌株C500一致,符合猪霍乱沙门氏菌的表型特征;携带平衡表达质粒pYA3493的重组菌株ΔasdC500(pYA3493)与C500的生长速度没有明显差别;根据Reed-Muench法,测定ΔasdC500(pYA3493)腹腔感染BALB/c小鼠的LD50为1.1×107CFU,毒力稍低于C500;口服接种ΔasdC500(pYA3493)和C500的所有仔猪未见任何发病症状,两者没有显著差别;携带重组质粒pYA-F1P2(含有支气管败血波氏杆菌抗原基因fhaB的TypeI区域和prn的R2区域)的重组菌株ΔasdC500(pYA-F1P2)能够稳定遗传重组质粒及其外源基因片段,并能稳定、高效、分泌性表达外源保护性抗原。由此表明,ΔasdC500保留了亲本菌株C500的一系列生物学特征,并可高效表达外源抗原,可作为沙门氏菌Asd+平衡表达系统开发基因工程重组疫苗。

关键词：沙门氏菌活疫苗载体 Asd^+平衡表达系统支气管败血波氏杆菌

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