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第15届世界禽病大会、中国畜牧兽医学会2007年学术年会

作者：徐晓娟徐高原周红波喻正军宋云峰金梅林陈焕春华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院华中农业大学动物医学院华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室

合成8对引物,通过 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)扩增了禽流感病毒 A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)(Dk/Hub/W1/04)全长的8个基因片段,所得的 cDNA(complementary DNA) 进行了序列分析,结果显示,PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和 NS 基因的大小依次为2341bp、2341bp、2233bp、 1742bp、1565bp、1457bp、1207bp 和890bp,以上序列在 GeneBank 的登陆号为：DQ465397～DQ465404。将该毒株与我国前期一些 H9N2代表性毒株的基因序列进行了同源性比较,结果表明,其8个基因与我国河北分离的 A/chicken/Hebei/31/2000(H9N2)毒株的同源性为99．0%～99．9%,与香港地区的毒株 A/Duck/ HongKong/Y280/97(H9N2)(Dk/HK/Y280/97)的同源性为97．8%～99．3%,与我国最早分离到的 H9N2的禽流感毒株 A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)(Ck/Beij/1/94)的同源为94．5%～98．2%。分子进化分析表明,Dk/ Hub/W1/04毒株的8个基因片段都来源于 Ck/Beij/1/94毒株,其中 HA 和 NA 基因与 Dk/HK/Y280/97毒株形成两个平行的亚群同时进化,而6个内部基因是由来源于 Ck/Beij/1/94的 Dk/HK/Y280/97毒株进一步进化而来。进一步对该毒株 HA 蛋白的预期氨基酸序列进行了分析,发现其的裂解位点为 R-S-S-R(Arg- Ser-Ser-Arg)模式,受体结合位点的226位为谷氨酸(Gln,Q),这些特征与 Ck/Beij/1/94毒株的一致。此外,Dk/Hub/W1/04毒株6个内部基因与湖北地区分离到的高致病性 H5N1禽流感病毒 A/chicken/Hubei/ 327/21304(H5N1)的同源性为88．0%～99．1%,进化关系也较远。总之,以上结果表明,Dk/Hub/W1/04是一株遗传进化上相对稳定的、保持了禽源特征的 H9N2亚型流感病毒毒株。

关键词：禽流感病毒基因组序列分析 A/duck/Hubei/W1/2004 分子进化

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以NP和M2为靶序列的RNA干扰分子抑制流感病毒在细胞和小鼠体内的复制

以NP和M2为靶序列的RNA干扰分子抑制流感病毒在细胞和小鼠体内的...

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第15届世界禽病大会、中国畜牧兽医学会2007年学术年会

作者：周红波全梅林喻正军徐晓娟彭亚平陈焕春华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室

本研究选用流感病毒中高度保守的 NP 和 M2基因作为 RNA 干扰的靶基因,设计了5对 siRNA(pS- NP749,pS-NP1383,pS-M48,pS-M754,pS-M949),通过载体介导,研究了这些 siRNA 对基因表达的影响

关键词：流感病毒 RNA 靶序列

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猪繁殖与呼吸综合征病毒HS株结构蛋白基因的克隆与序列分析

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动物医学进展 2007年第6期28卷 1-4页

作者：马朝志肖少波宁娟江云波方六荣陈焕春华中农业大学动物医学院动物病毒室农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲株（VR-2332）基因序列，设计合成了ORF2a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的引物。利用RT-PCR扩增出PRRSV HS株各基因的cDNA片段，将扩增的各cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序。应... 详细信息

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲株（VR-2332）基因序列，设计合成了ORF2a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的引物。利用RT-PCR扩增出PRRSV HS株各基因的cDNA片段，将扩增的各cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序。应用DNAMan软件，将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株（VR-2332、Resp MLV、16244B、HN1、BJ-4、CH1-a、HB-1、HB-2、LV）的相应基因进行序列比较，并绘制系统进化树。结果表明，PRRSV HS株与美洲型的相应基因核苷酸同源性为83．6％～99．79／6，与LV株的相应基因核苷酸同源性为38．9％～49％；推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为86．6％～99．6％，与LV株的同源性为54．2％～78．2％。系统进化树表明，PRRSV HS株属于美洲型，与HN1、VR-2332、RespMLV、16244B、BJ-4亲缘关系较近。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因 RT—PCR 序列分析

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血清7型胸膜肺炎放线杆菌apxIIC-/apxIA+基因缺失重组菌株的构建与鉴定

血清7型胸膜肺炎放线杆菌apxIIC-/apxIA+基因缺失重组菌株的构建...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：刘金林林荔雯贝为成陈焕春华中农业大学动物医学院动物传染病研究室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物病原分室

通过接合转移和SacB负向筛选的方法,我们构建了一株apxIIC缺失的血清7型胸膜肺炎放线杆菌重组菌株。首先构建重组转移质粒pEHA1。将pEHA1转化供体大肠杆菌β2155,并将其与野生型APP血清7型亲本菌混合培养5小时,然后涂到含霉素抗性的培... 详细信息

通过接合转移和SacB负向筛选的方法,我们构建了一株apxIIC缺失的血清7型胸膜肺炎放线杆菌重组菌株。首先构建重组转移质粒pEHA1。将pEHA1转化供体大肠杆菌β2155,并将其与野生型APP血清7型亲本菌混合培养5小时,然后涂到含霉素抗性的培养基上培养,挑取阳性克隆,接种到无抗性液体培养基,培养后涂于含有蔗糖的的培养基,培养一定时间后挑取蔗糖抗性的克隆,即可得到目的突变株。通过PCR、遗传稳定性、外毒素分泌、重组位点序列分析验证了重组菌构建成功。我们对重组菌生物学特性进行了初步研究,发现其增殖能力未受影响,对小鼠毒力显著降低。该突变株构建体系的建立为猪传染性胸膜肺炎减毒活疫苗的开发以及对胸膜肺炎放线杆菌特定基因的功能研究奠定了良好基础。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌接合转移负向筛选重组菌株构建鉴定

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利用S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白

利用S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白

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2007年中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会学术研讨会

作者：刘梅郭素霞胡思顺肖运才许青荣毕丁仁孙明华中农业大学动物医学院武汉 430070 农业微生物学国家重点实验室武汉 430070 农业微生物学国家重点实验室武汉 430070 华中农业大学动物医学院武汉 430070 华中农业大学动物医学院武汉 430070 农业微生物学国家重点实验室武汉 430070

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白PMGA1.2的可行性及其免疫原性，为研制能常温长期保藏和运输的禽用口服疫苗奠定基础。用部分pmga1.2基因(pmga1.2p)代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表... 详细信息

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白PMGA1.2的可行性及其免疫原性，为研制能常温长期保藏和运输的禽用口服疫苗奠定基础。用部分pmga1.2基因(pmga1.2p)代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列sIh下游的片段，构建了2个融合基因ctc-pmga1.2p和csa-ctc-pmga1.2p(csa表csaAB操纵元，其与S-层蛋白牢固地锚定到细胞表面密切相关);将含融合基因的重组质粒电转化入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中，获得了2个重组菌株BCCG(含ctc-pmga1.2p和携带csaAB操纵元的质粒)和CG(含csa-ctc-pmga1.2p)。血凝和血凝抑制试验结果显示，2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组蛋白PMGA1.2P;小鼠免疫学实验证实，2个重组菌株所展示的重组蛋白均具有免疫原性，其中，重组菌株CG的免疫效果优于BCCG。结果表明，苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可被用来研制热稳定性禽用口服疫苗。

关键词：苏云金芽胞杆菌鸡毒霉形体粘附素蛋白口服疫苗融合基因免疫原性

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H1N1亚型猪流感病毒的拯救

H1N1亚型猪流感病毒的拯救

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“环境与健康”学术研讨会

作者：彭亚平周红波李春金梅林农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院

目的:利用8质粒拯救系统拯救猪流感病毒毒株 A/Swine/TianJin/01/ 2004(H1N1)(A/S/TJ/04)。方法:将猪流感病毒8个基因节段经 RT-PCR 合成 cDNA 后,分别克隆到 RNA 聚合酶Ⅰ/Ⅱ双向表达载体 PHW2000中,构建成8 个重组质粒。用8个重组质... 详细信息

目的:利用8质粒拯救系统拯救猪流感病毒毒株 A/Swine/TianJin/01/ 2004(H1N1)(A/S/TJ/04)。方法:将猪流感病毒8个基因节段经 RT-PCR 合成 cDNA 后,分别克隆到 RNA 聚合酶Ⅰ/Ⅱ双向表达载体 PHW2000中,构建成8 个重组质粒。用8个重组质粒共转染 COS-1细胞,30小时后加入 TPCK-胰酶至终浓度0.5μg/mL。共转染48小时后收获 COS-1细胞及其上清,经尿囊腔接种9 日龄 SPF 鸡胚。收获死亡鸡胚尿囊液并继续用 SPF 鸡胚传3代,得到有感染性的病毒。经血凝、血凝抑制实验、测序分析、电镜观察等均证实了 A/S/TJ/04猪流感病毒的成功拯救。结论:用8质粒拯救系统成功拯救出了 H1N1亚型猪流感病毒。

关键词：猪流感病毒双向表达载体拯救共转染

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猪源支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素基因的原核表达及其免疫原性与抗体检测ELISA方法研究

猪源支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素基因的原核表达及其免疫...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：赵战勤薛云吴斌汤细彪何华胡睿铭张建民陈焕春华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室

支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)可引起猪发生肺炎和萎缩性鼻炎。更重要的是,该菌的先期感染易于导致其它多种病原的继发感染,加重病情造成较严重损失。百日咳杆菌黏附素是由Bbprn基因编码的一种重要的黏附因子,被认... 详细信息

支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)可引起猪发生肺炎和萎缩性鼻炎。更重要的是,该菌的先期感染易于导致其它多种病原的继发感染,加重病情造成较严重损失。百日咳杆菌黏附素是由Bbprn基因编码的一种重要的黏附因子,被认为是Bb最主要的保护性抗原。本研究克隆了猪源Bb强毒株HH0809的prn基因,利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统在大肠杆菌中进行了融合表达。克隆基因的核苷酸和氨基酸序列与GeneBank已经提交的所有猪源Bb的prn序列均具有98%以上的同源性。利用ProtParam软件对融合表达蛋白的理化性质进行预测分析,结果显示不稳定系数为38.33,属于稳定型蛋白质。SDS-PAGE和Western blot检测证实该基因获得高效表达并具有良好的免疫学活性。经GST融合蛋白纯化试剂Glutathione SepharoseTM4B纯化后,得到浓度为207.3μg/mL、纯度为90.1%的融合蛋白GST-PRN。在小鼠免疫保护力试验中,重组蛋白免疫组BalB/C小鼠能够抵抗3.2×LD50量的Bb强毒株HH0809的呼吸道气雾攻击,保护率为100%(20/20),而GST载体蛋白对照组和PBS空白对照组的小鼠分别存活了4只和3只。这证明原核表达的PRN蛋白具有天然PRN外膜蛋白的免疫效力,可考虑作为新型疫苗或疫苗添加成分。通过凝血酶Thrombin酶切融合表达产物GST-PRN并回收,获得纯度为93.1%、浓度为120.5μg/mL的不含GST载体蛋白的PRN蛋白片段。以PRN蛋白片段为抗原建立检测百日咳杆菌黏附素抗体的间接ELISA方法。方阵滴定结果显示,血清最佳稀释度为1:40,PRN抗原最佳稀释度为1:320(43.9μg/孔)。阴阳性临界点为0.335。重复实验中变异系数最大为7.83%,最小为3.51%。猪巴氏杆菌病、猪大肠杆菌病、仔猪副伤寒、猪传染性胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪气喘病阳性血清和5份猪波氏菌病阴性血清用ELISA检测都呈阴性。ELISA方法对2份接种了猪波氏菌病灭活菌苗的猪血清和2份Bb感染猪血清的检测结果均为阳性。敏感性试验表明,该ELISA方法的敏感性比本实验室已经建立的乳胶凝集试验方法高4～128倍;该ELISA方法能够检测到人工感染Bb仔猪14d的血清抗体IgG。该ELISA方法对临床送检的1229份猪血清的检测阳性率为32.7%。同时,该方法对湖北2个阳性猪场各年龄段猪群的临床监测结果表明,生长前期(36～55日龄)和育肥期(56～90日龄)猪群的阳性率明显高于断奶前(15～21日龄)和保育期(22～35日龄)猪群。本研究建立的PRN抗体监测ELISA方法具有较好的重复性、特异性和敏感性,有望成为一种准确、快速和实用的猪波氏菌病血清学诊断方法。

关键词：支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素免疫原性 ELISA

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伪狂犬病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达

伪狂犬病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：薛念波肖少波江云波金黎亮常天明陈焕春方六荣华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院动物病毒室

本研究以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增含UL18全长基因,将PCR产物克隆于PMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定。序列分析显示UL18全长891bp,可编码297个氨基酸。将该基因亚克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下... 详细信息

本研究以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增含UL18全长基因,将PCR产物克隆于PMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定。序列分析显示UL18全长891bp,可编码297个氨基酸。将该基因亚克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下游,获得原核表达质粒pQE-82L-UL18,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达获得分子量约33kD的融合表达蛋白6×His-UL18,Western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。进一步将UL18基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL18,转染Hela细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现转染后24h融合蛋白EGFP-UL18主要定位在细胞浆,仅有部分定位于细胞核,而48h则主要定位在细胞核。本研究为进一步研究伪狂犬病毒UL18基因的结构和功能奠定了基础。

关键词：伪狂犬病毒 UL18基因序列分析表达

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RNA干扰抗A型流感病毒的研究

RNA干扰抗A型流感病毒的研究

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第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会

作者：周红波金梅林喻正军徐晓娟彭亚平伍海芽刘金林刘虎曹胜波陈焕春华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院动物病毒实验室

RNA 干扰是抑制基因表达的强有力工具。近年来,利用小 RNA 诱导 RNA 降解已被广泛应用来研究抗病毒制剂。本研究中,我们以流感病毒中高度保守基因 NP 和 M2为靶序列设计了5对 siRNA(pS-M48,pS-M754,pS-M949,pS-NP749

关键词：

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抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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动物医学进展 2007年第11期28卷 1-4页

作者：孙颖马艳李彬江云波肖少波方六荣陈焕春华中农业大学动物医学院湖北武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

以大肠埃希菌表达的与GST融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、克隆后,获得1株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为52-C.52-C杂交瘤细胞染色体平均数为90条(86～96);... 详细信息

以大肠埃希菌表达的与GST融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、克隆后,获得1株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为52-C.52-C杂交瘤细胞染色体平均数为90条(86～96);经间接ELISA鉴定,单抗52-C为IgG2a亚型;腹水效价为100×27;与伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应;不能中和PRRSV.以表达的GP5不同突变体为抗原经间接ELISA和Western blot证实,单克隆抗体52-C针对的表位位于GP5蛋白的胞内区.

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白单克隆抗体鉴定

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