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畜牧兽医学报 2022年第1期53卷 219-230页

作者：肖静肖坤雪王翘楚陈焕春蔡旭旺徐晓娟华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北省预防兽医学重点实验室武汉430070

本研究旨在利用Flp-FRT位点特异性重组系统建立副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis)的无抗性标记基因敲除方法,为***的毒力因子、致病机制和基因工程疫苗研究提供有力的遗传操作工具。首先利用λ噬菌体cI857/P_(RM)/P_(R)基因表达调控... 详细信息

本研究旨在利用Flp-FRT位点特异性重组系统建立副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis)的无抗性标记基因敲除方法,为***的毒力因子、致病机制和基因工程疫苗研究提供有力的遗传操作工具。首先利用λ噬菌体cI857/P_(RM)/P_(R)基因表达调控系统调控Flp重组酶的表达,实现抗性突变体中抗性基因的消除;然后将Flp表达质粒电转化引入*** CF7066,再自然转化介导同源重组的自杀性质粒获得有抗性标记的基因缺失突变株,调节Flp酶表达并筛选无抗突变株,提高培养温度消除表达Flp酶的温敏质粒;进一步通过筛选突变FRT位点以保证基因敲除的效率。结果表明成功构建了温敏穿梭质粒pSHG5C-Flp,证实了λcI857/P_(RM)/P_(R)表达系统可调控Flp重组酶在***中表达并切除抗性突变株ΔnanH::Kan_(R)中的抗性基因;然后用Flp重组酶表达质粒pSHG5C-Flp电转化*** CF7066,再用自杀性质粒pKF-ΔnanH和pKF-Δapd2对其进行两次连续自然转化,依次在自然转化的初代转化子中筛选并获得了无抗的单基因缺失株ΔnanH和双基因缺失株ΔnanHΔapd,提高培养温度至42℃培养消除了Flp重组酶表达质粒。尽管该系统实现了***两个基因的连续敲除,但敲除第2个基因时的效率明显下降,这很可能源于细菌细胞中Flp重组酶表达的积累,对转化质粒介导的同源重组产生了干扰。因此,作者筛选了突变的FRT位点、构建自杀性质粒pKFM-Δapd进行自然转化,显著提高了自然转化后获得突变株的效率,从而保证了该敲除系统的有效性和稳定性。本研究首次报道了可用于***的无抗性标记双基因缺失突变系统,为其分子致病基因与基因工程疫苗的研究奠定了基础。

关键词：副猪嗜血杆菌表达调控 Flp-FRT 基因敲除无抗缺失

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猪伪狂犬病基因缺失疫苗的制备、安全性、免疫原性、保存期测定及区域试验

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畜牧兽医学报 2005年第10期36卷 1055-1063页

作者：何启盖方六荣吴斌刘正飞吴美洲肖少波金梅林陈焕春华中农业大学动物医学院预防兽医学湖北省重点实验室农业微生物学国家重点实验室武汉430070

为了提供有效的伪狂犬病疫苗,用鸡胚成纤维细胞扩大培养了PrV HB-98突变株(TK-/gG-/LacZ+),研制了伪狂犬病基因缺失疫苗,并对该疫苗经肌肉接种、经口等免疫途径的最小免疫剂量进行了测定,同时也对4批疫苗的安全性、效力、免疫期和保存... 详细信息

为了提供有效的伪狂犬病疫苗,用鸡胚成纤维细胞扩大培养了PrV HB-98突变株(TK-/gG-/LacZ+),研制了伪狂犬病基因缺失疫苗,并对该疫苗经肌肉接种、经口等免疫途径的最小免疫剂量进行了测定,同时也对4批疫苗的安全性、效力、免疫期和保存期进行了检测;同时将4批疫苗用于免疫23个猪场的母猪、新生仔猪和育肥猪进行区域试验。测定结果表明,疫苗经上述两种途径接种对不同阶段猪的最小免疫剂量均为105.0TCID50;10倍免疫剂量的疫苗对初生仔猪、15日龄仔猪和妊娠母猪是安全的,免疫猪能抵抗强毒的攻击;疫苗在4℃和-20℃下分别可保存6个月和12个月。对伪狂犬病毒抗体阴性的70日龄商品猪和种猪的免疫期为6个月。田间试验表明,4批猪伪狂犬病基因缺失疫苗安全有效,并可用于仔猪发病时的紧急接种。为猪伪狂犬病基因工程疫苗的制备与应用提供了有力的依据。

关键词：伪狂犬病基因疫缺失苗 PrY HK-98突变株安全性免疫原性区域试验

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粪类圆线虫虾青素金属蛋白酶基因的克隆、表达及定位分析

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中国兽医学报 2023年第1期43卷 98-105页

作者：张碧瀛单嘉男覃裴溪周涛勋周焕胡敏华中农业大学、动物医学院、农业微生物学国家重点实验室武汉湖北430070

虾青素金属蛋白酶是一种广泛存在于多种动物体内的金属蛋白酶,研究表明该蛋白酶在寄生线虫的入侵和生长发育过程中发挥重要作用。但目前对粪类圆线虫虾青素金属蛋白酶(Ss-AST-1)还所知甚少,研究旨在对该酶编码基因(Ss-ast-1)进行鉴定和... 详细信息

虾青素金属蛋白酶是一种广泛存在于多种动物体内的金属蛋白酶,研究表明该蛋白酶在寄生线虫的入侵和生长发育过程中发挥重要作用。但目前对粪类圆线虫虾青素金属蛋白酶(Ss-AST-1)还所知甚少,研究旨在对该酶编码基因(Ss-ast-1)进行鉴定和表达分析,为进一步研究其功能奠定基础。利用生物信息学方法对Ss-ast-1基因进行序列分析,通过转录组数据分析Ss-ast-1在各个发育阶段的转录水平,转基因技术进行虫体内表达定位分析。通过体外原核表达重组蛋白,Western blot分析其抗原性。采用免疫荧光组织化学方法对Ss-AST-1在粪类圆线虫幼虫体内的定位进行研究。结果显示:Ss-ast-1基因全长1905 bp,编码634个氨基酸;转录组分析该基因在iL3期的表达水平最高。定位分析表明该蛋白在虫卵细胞的细胞核和细胞质均有表达;体外表达重组蛋白的大小约67.5 kDa,Western blot分析表明多克隆抗体可以较好的识别全虫蛋白中的Ss-AST-1。免疫荧光结果显示Ss-AST-1在幼虫体内表达并分布幼虫的头部和体壁。Ss-ast-1属于虾青素金属蛋白酶家族,其可能在寄生虫入侵过程中发挥作用,为进一步探究粪类圆线虫蛋白功能奠定了良好的基础。

关键词：粪类圆线虫虾青素金属蛋白酶原核表达显微注射

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新型猪流行性腹泻的诊断控制及其病原分子特征

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中国兽医科学 2016年第2期46卷 149-156页

作者：吴美洲陈芳洲周春陵朱银杏库旭钢刘洋谭鑫姚丽何启盖华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 华中农业大学动物医学院湖北武汉430070

2015年10月,曾免疫过猪流行性腹泻-传染性胃肠炎-轮状病毒三联活疫苗的某规模化猪场中50多头母猪出现腹泻症状,大约有600头新生仔猪的死亡,其中1周龄发病仔猪的死亡率达到95%。主要的临床症状是消瘦、被毛粗乱无光泽、水样腹泻及呕吐。... 详细信息

2015年10月,曾免疫过猪流行性腹泻-传染性胃肠炎-轮状病毒三联活疫苗的某规模化猪场中50多头母猪出现腹泻症状,大约有600头新生仔猪的死亡,其中1周龄发病仔猪的死亡率达到95%。主要的临床症状是消瘦、被毛粗乱无光泽、水样腹泻及呕吐。通过临床调查、病理解剖观察、抗体检测、PCR检测和Sl基因、ORF3基因序列分析,确诊该病是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株引起,通过对仔猪血液中针对猪流行性腹泻(PED)的IgA和IgG抗体的ELISA方法检测发现,这些样品中IgA和IgG抗体水平较高,但仍然不能提供较好的免疫保护。采取母猪紧急接种YN144变异毒株制成的疫苗,配合迅速隔离发病猪只,加强保温和消毒等综合措施,迅速控制了该病。

关键词：猪流行性腹泻新型猪流行性腹泻病毒诊断控制分子特征

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神农架川金丝猴源肠道粪肠球菌的分离与鉴定

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兽类学报 2017年第4期37卷 389-398页

作者：呙会会白文妹李翔杨敬元姚辉肖运才华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北神农架金丝猴保育生物学湖北省重点实验室

通过培养特征、形态观察、抑菌性实验,从神农架健康野生金丝猴肠道分离到8株抑菌效果明显的菌株;生理生化鉴定和16S rRNA基因序列同源性分析,该8株菌为粪肠球菌。毒力因子检测和动物急性毒性实验筛选出2株安全性良好的菌株,研究两菌株... 详细信息

通过培养特征、形态观察、抑菌性实验,从神农架健康野生金丝猴肠道分离到8株抑菌效果明显的菌株;生理生化鉴定和16S rRNA基因序列同源性分析,该8株菌为粪肠球菌。毒力因子检测和动物急性毒性实验筛选出2株安全性良好的菌株,研究两菌株对胃肠道环境(低pH值、高胆盐)的耐受特性和生长情况。结果表明,粪肠球菌dlt7a和dlt7b株繁殖能力很强,无迟缓期,具有较强的耐受胃酸及肠道高胆盐环境的能力,且安全性好,具有较好的益生特性,可作为金丝猴微生态制剂的候选菌株。

关键词：金丝猴粪肠球菌分离鉴定益生菌

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丁型冠状病毒我国猪源株的遗传变异分析

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中国兽医科学 2016年第6期46卷 689-694页

作者：吴美洲陈芳洲朱银杏李中华库旭钢刘洋何启盖华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 华中农业大学动物医学院湖北武汉430070

猪丁型冠状病毒病(PDCo VD)是新近报道的呈现世界流行性的猪肠道病毒病。为掌握我国猪丁型冠状病毒(PDCo V)的遗传变异特征,本研究对2014年11月至2015年5月之间采集的我国3个省的10个猪场的64份样品进行了检测,并对8个PDCo V毒株的S基... 详细信息

猪丁型冠状病毒病(PDCo VD)是新近报道的呈现世界流行性的猪肠道病毒病。为掌握我国猪丁型冠状病毒(PDCo V)的遗传变异特征,本研究对2014年11月至2015年5月之间采集的我国3个省的10个猪场的64份样品进行了检测,并对8个PDCo V毒株的S基因全长以及其中一个毒株的全基因组序列进行了测序分析,PDCo V的检测率为23.4%,比猪流行性腹泻病毒(PEDV)的检测率17.2%要高,同时PDCo V的单独感染率为17.2%,与PEDV混合感染率是6.4%,系统进化树表明本试验中的SXD1毒株与之前我国香港报道的毒株HKU15-44和HKU15-155的同源性最近,而这些毒株可能来自于中国大陆地区,且Song等进行的回溯性检测检到了PDCo V,表明PDCo V是一种重要的猪病毒性腹泻病病原,早就存在但未被检出。S蛋白的第52位氨基酸编码基因的缺失可以作为区分我国PDCo V毒株和韩国以及美国PDCo V毒株的标记。同时PDCo V毒株基因组上的ORF1a、S基因和N基因的变异提示我国应加强PDCo V的监控,尽快研制出针对PDCo VD的疫苗。

关键词：猪丁型冠状病毒病猪丁型冠状病毒 S基因全基因组遗传变异

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伪狂犬病毒Ea株UL38基因的克隆、序列分析及表达

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中国兽医学报 2009年第2期29卷 178-181,186页

作者：薛念波方六荣江云波俞明敏李彬罗锐陈焕春肖少波华中农业大学动物医学院动物病毒室湖北武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL38全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定。序列分析显示UL38基因全长1 107 bp,可编码369个氨基酸。将该基因克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下游... 详细信息

以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL38全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定。序列分析显示UL38基因全长1 107 bp,可编码369个氨基酸。将该基因克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下游,获得原核表达质粒pQE-UL38,IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达并获得相对分子质量约40 000的融合表达蛋白6×His-UL38,Western blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。进一步将UL38基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL38,转染Hela细胞,24、48 h通过激光共聚焦显微镜观察显示pEGFP-UL38,24 h荧光主要分布在胞浆,有部分分布在核内,但随时间延长,荧光逐渐向细胞核中转移,在转染后48 h几乎完全定位于核内。但对照载体pEGFP-N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞。

关键词：伪狂犬病毒 UL-38基因序列分析表达

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猪源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

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中国农业科学 2008年第12期41卷 4209-4217页

作者：赵战勤裴洁薛云汤细彪吴斌何华周学利程相朝何启盖陈焕春华中农业大学动物医学院/农业微生物学国家重点实验室河南科技大学动物科技学院

【目的】探讨2003～2006年间支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)在中国湖北等十余省市猪群中的流行病学分布和协同感染特性并对部分菌株进行生物学特性研究。【方法】采用病原菌的形态学观察、生化鉴定和PCR鉴定,从2 05... 详细信息

【目的】探讨2003～2006年间支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)在中国湖北等十余省市猪群中的流行病学分布和协同感染特性并对部分菌株进行生物学特性研究。【方法】采用病原菌的形态学观察、生化鉴定和PCR鉴定,从2 057份有肺炎或萎缩性鼻炎症状猪的肺脏等病料组织中分离出190株Bb和不同数量的其它共感染菌。经生化鉴定,药敏试验、血凝试验及动物试验等方法进行检测和分析。【结果】在中国湖北等十余省市的猪群中,不同省份Bb的总分离率介于7.3%～14.1%之间;不同年份Bb的总分离率介于7.3%～11.8%之间;2003～2006年间的Bb总分离率为9.2%;Bb的分离率与猪日龄有一定的关系。Bb最常见的共感染菌依次是链球菌(55.9%)、副猪嗜血杆菌(50.0%)、大肠杆菌(43.1%)、巴氏杆菌(25.5%)、绿脓杆菌(17.6%)和沙门氏菌(11.8%)。在43份有典型萎缩性鼻炎症状猪的病料中,分离出22株Bb、7株产毒素巴氏杆菌和6株绿脓杆菌;在分离出产毒素巴氏杆菌的7份病料中均同时分离出了Bb,而其中6份又同时分离出了绿脓杆菌。对2003年分离的31株Bb进行药敏试验、红细胞凝集试验和乳鼠皮肤坏死试验。结果表明:各菌株对15种药物的耐药谱不同,但对卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素B、环丙沙星和舒普深高度敏感;各菌株均可凝集猪和羊的红细胞且能不同程度导致乳鼠皮肤坏死。【结论】在中国湖北等十余省市的猪群中,Bb与其它病原菌的共感染情况非常严重,且在萎缩性鼻炎的病猪中检出率最高。

关键词：支气管败血波氏杆菌流行病学协同感染毒力因子

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P58IPK通过PERK/eIF2α通路调控猪圆环病毒2型所诱导的细胞自噬

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畜牧兽医学报 2017年第11期48卷 2125-2134页

作者：杨了寒王凯许苏童张敏胡林何启盖张淑君华中农业大学动物科学技术学院农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室武汉430070 华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070

旨在研究猪圆环病毒2型(PCV2)感染激活的PERK/eIF2α通路是否与细胞自噬相关,以及过表达分子伴侣蛋白P58IPK在其中的作用。首先通过PERK特异性抑制剂GSK2606414和siRNA及蛋白免疫印迹检测磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、LC3-Ⅱ和ATG5-ATG12蛋... 详细信息

旨在研究猪圆环病毒2型(PCV2)感染激活的PERK/eIF2α通路是否与细胞自噬相关,以及过表达分子伴侣蛋白P58IPK在其中的作用。首先通过PERK特异性抑制剂GSK2606414和siRNA及蛋白免疫印迹检测磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、LC3-Ⅱ和ATG5-ATG12蛋白表达,研究PCV2感染PK-15细胞24h后PERK/eIF2α通路与细胞自噬的关系;然后通过构建和瞬时转染P58IPK真核过表达质粒及蛋白免疫印迹研究过表达P58IPK对PCV2感染PK-15诱导的PERK/eIF2α通路及细胞自噬的影响。结果显示,PERK特异性抑制剂GSK2606414和siRNA干扰PERK可极显著抑制PCV2诱导的p-eIF2α(P<0.01)和LC3-Ⅱ(P<0.01)表达;而过表达P58IPK同样可以极显著下调PCV2诱导的p-eIF2α(P<0.01)、ATG5-ATG12(P<0.01)及LC3-Ⅱ(P<0.01),且能极显著下调PCV2拷贝数(P<0.01)。结果表明,PCV2感染PK-15通过激活PERK/eIF2α通路诱导细胞自噬,过表达P58IPK通过抑制PERK通路抑制PCV2诱导的细胞自噬,从而抑制病毒复制。

关键词： P58IPK 内质网应激细胞自噬 PERK PCV2 ATG12

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猪Beclin1基因调控伪狂犬病病毒诱导细胞自噬和凋亡的机制分析

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畜牧兽医学报 2018年第6期49卷 1274-1281页

作者：胡林南良康张敏许苏童杨了寒李帅峰王凯刘正飞张淑君华中农业大学动物科学技术学院农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室武汉430070 华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070

旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)感染后细胞自噬和凋亡情况,进一步分析鉴定PRV感染条件下与Beclin1互作的猪宿主凋亡家族蛋白。利用免疫印迹(WB)方法检测PRV感染细胞的自噬水平;利用流式细胞术探讨凋亡水平;最后利用免疫共沉淀试验分析PRV感... 详细信息

旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)感染后细胞自噬和凋亡情况,进一步分析鉴定PRV感染条件下与Beclin1互作的猪宿主凋亡家族蛋白。利用免疫印迹(WB)方法检测PRV感染细胞的自噬水平;利用流式细胞术探讨凋亡水平;最后利用免疫共沉淀试验分析PRV感染PK-15细胞中Beclin1与Bcl-2和Bcl-xL的结合水平。结果显示,PRV感染导致LC3-Ⅱ的表达明显增多,而P62显著下降,且AKT(S473)磷酸化水平显著减少;其次,PRV感染诱导细胞凋亡且显著上调剪切型Caspase-9/8的表达水平;最后,免疫共沉淀结果显示PRV感染条件下Beclin1能与Bcl-2和Bcl-xL结合,但结合的水平明显降低。PRV感染诱导的细胞自噬可能依赖于PI3K-Ⅰ/AKT信号通路,PRV感染可能同时激活了线粒体凋亡途经和死亡受体途经从而诱导细胞凋亡,而PRV感染诱导的细胞自噬和细胞凋亡可能通过抑制Beclin1和Bcl-2、Bcl-xL结合而相互关联。

关键词： PRV 细胞自噬细胞凋亡 Beclin1

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