检索结果-内蒙古大学图书馆

猪肺炎支原体乳酸脱氢酶基因的克隆、表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立

中国兽医学报 2007年第4期27卷 511-515,531页

作者：姚睿玉何启盖周锐陈焕春华中农业大学动物医学院湖北省预防兽医学重点实验室

根据GenBank中的猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(LDH)基因序列设计1对引物,PCR扩增LDH基因,首先将扩增片段连接到克隆载体pMD18-T上,然后连接到表达载体pGEX-KG上,经测序正确后诱导表达。重组质粒在大肠杆菌中表达的目的蛋白以可溶性蛋白和包涵... 详细信息

根据GenBank中的猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(LDH)基因序列设计1对引物,PCR扩增LDH基因,首先将扩增片段连接到克隆载体pMD18-T上,然后连接到表达载体pGEX-KG上,经测序正确后诱导表达。重组质粒在大肠杆菌中表达的目的蛋白以可溶性蛋白和包涵体2种形式存在。将超声波破碎的诱导菌液高速离心,其上清用Glutathione Sepharose 4B bead亲和层析纯化。用猪肺炎支原体的标准阳性血清对纯化蛋白作Western-blot检测,出现目的条带;以纯化蛋白为抗原建立了检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA方法,该方法具有较好的稳定性和重复性,较高的特异性与敏感性。用建立的ELISA方法与中国兽医药品监察所研制的IHA试剂盒同时检测120份临床血清,二者总符合率为92.5%。用建立的ELISA方法检测了671份临床送检不同年龄阶段的猪血清,结果显示断奶前仔猪猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopnenmoniae,MHP)感染率为44.3%,保育猪为3.0%,育肥猪为17.44%,种猪为73.41%,这初步反映了猪喘气病在各个年龄阶段的感染率。

关键词：猪肺炎支原体乳酸脱氢酶基因抗体检测ELISA 诊断

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金黄色葡萄球菌对苯扎溴铵敏感性与生物被膜形成能力相关性分析

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畜牧兽医学报 2024年第8期55卷 3669-3677页

作者：崔恒洁覃金珑朱志豪鲍雪栗绍文孟宪荣华中农业大学动物医学院武汉430070 华中农业大学动物医学院湖北省预防兽医学重点实验室武汉430070

以35株生猪屠宰场及养殖场来源的金黄色葡萄球菌分离菌株为试验材料,分析金黄色葡萄球菌对苯扎溴铵敏感性与生物被膜形成能力的相关性。采用微量肉汤稀释法检测金黄色葡萄球菌对苯扎溴铵的敏感性,结晶紫染色法检测生物被膜形成能力,基... 详细信息

以35株生猪屠宰场及养殖场来源的金黄色葡萄球菌分离菌株为试验材料,分析金黄色葡萄球菌对苯扎溴铵敏感性与生物被膜形成能力的相关性。采用微量肉汤稀释法检测金黄色葡萄球菌对苯扎溴铵的敏感性,结晶紫染色法检测生物被膜形成能力,基于全基因组测序结果分析屠宰环节的26株金黄色葡萄球菌多位点序列分型(multi-locus sequence typing,MLST)情况,以及消毒剂抗性与生物被膜形成相关基因的携带情况。结果表明,35株菌中,苯扎溴铵的最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)范围为1~16 mg·L^(-1),强成膜能力菌株共16株,占总数的45.71%(16/35),其中93.75%(15/16)来自于屠宰链的下游。ST7是强成膜能力菌株的优势序列型(93.75%,15/16)。金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力和苯扎溴铵MBC值呈正相关(相关系数为0.690),而消毒剂抗性与相关基因携带情况无关。综上,金黄色葡萄球菌可通过形成生物被膜提高对消毒剂的耐受性,减弱了苯扎溴铵的消毒效果,增加了养殖和屠宰环节中细菌污染和传播的风险。

关键词：金黄色葡萄球菌生物被膜苯扎溴铵相关性

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一株猪源鼠伤寒沙门氏菌的耐药性鉴定及其消除

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微生物学报 2006年第5期46卷 789-795页

作者：贾爱卿刘维红郭爱珍陈焕春华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北省预防兽医学重点实验室

猪源鼠伤寒沙门氏菌临床分离株17Y,检测其对19种抗生素的耐药性,结果耐14种抗生素。用高温及高浓度SDS处理后,获得对11种抗生素的敏感性,该菌株命名为17S1。PCR检测证明,大部分耐药基因存在于质粒上,包括I型整合子携带耐药基因,且随着... 详细信息

猪源鼠伤寒沙门氏菌临床分离株17Y,检测其对19种抗生素的耐药性,结果耐14种抗生素。用高温及高浓度SDS处理后,获得对11种抗生素的敏感性,该菌株命名为17S1。PCR检测证明,大部分耐药基因存在于质粒上,包括I型整合子携带耐药基因,且随着质粒的消除而被消除。所鉴定的耐药基因有blaTEM、blaOXA-1、cat1、tet(B)、aacC2、aadA8b、dhfrXⅡ和sul1等。喹诺酮类药物的靶基因gyrA与parC位于染色体上。GyrA在耐药决定区第87位氨基酸突变(N78D),导致了喹诺酮类药物的耐药性逆转。敏感菌中扩增不到质粒毒力基因spv与rck。耐药性消除后的菌株17S1对小鼠的毒力降低(LD50增加10倍),在小鼠体内的增长与散速度也显著降低(P<0.05)。以上证据表明,鼠伤寒沙门氏菌的多重耐药性主要由质粒决定,研究开发新型质粒消除剂将对克服鼠伤寒沙门氏菌多重耐药性具有重要意义。

关键词：鼠伤寒沙门氏菌耐药性质粒消除细菌毒力整合子

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地方鸡禽白血病病毒感染调查及主要流行亚群分析

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华中农业大学学报 2020年第3期39卷 89-93页

作者：杨荣坤许青荣崔卫涛肖运才李自力周祖涛华中农业大学动物医学院/湖北省预防兽医学重点实验室武汉430070

为了解湖北省地方鸡禽白血病病毒的感染状态及主要流行亚群,从麻城绿壳蛋鸡、江汉鸡、景阳鸡3个地方品种核心群采集了7477份样品,进行蛋清p27抗原检测、公鸡病毒分离鉴定及分离株gp85基因序列分析。结果显示:3个地方鸡种蛋清p27抗原阳... 详细信息

为了解湖北省地方鸡禽白血病病毒的感染状态及主要流行亚群,从麻城绿壳蛋鸡、江汉鸡、景阳鸡3个地方品种核心群采集了7477份样品,进行蛋清p27抗原检测、公鸡病毒分离鉴定及分离株gp85基因序列分析。结果显示:3个地方鸡种蛋清p27抗原阳性率分别为1.32%、6.54%和2.82%,公鸡病毒分离率为6.11%、30.14%和8.64%,表明湖北省地方鸡禽白血病病毒感染比较严重,不同品种的感染率不同,公鸡的排毒率高于母鸡。利用PCR方法将分离的15株禽白血病病毒分为两大亚群,分离株gp85基因遗传进化分析结果显示,3个地方鸡品种主要流行J、K亚群禽白血病病毒,均存在J、K亚群禽白血病病毒的共感染,表明湖北省地方鸡禽白血病病毒感染情况较为复杂。

关键词：禽白血病病毒鸡病毒感染病毒分离 gp85基因病毒亚群禽病净化

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猪结合珠蛋白基因的克隆、原核表达及单克隆抗体制备

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中国兽医学报 2010年第9期30卷 1245-1247页

作者：喻翠翠孟宪荣栗绍文梅仕林张望周蕾蕾陈辉毕丁仁华中农业大学动物医学院预防兽医学湖北省重点实验室湖北武汉430070

本研究的目的在于利用重组猪结合珠蛋白(Haptoglobin,Hp)制备特异性单克隆抗体。以梅山猪肝脏总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增猪hp基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-KG和pET-32a上,转化至***21中,IPTG诱导下高效表达重组GST-Hp和HIS-Hp... 详细信息

本研究的目的在于利用重组猪结合珠蛋白(Haptoglobin,Hp)制备特异性单克隆抗体。以梅山猪肝脏总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增猪hp基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-KG和pET-32a上,转化至***21中,IPTG诱导下高效表达重组GST-Hp和HIS-Hp蛋白。用纯化的重组GST-Hp免疫BALB/c小鼠,用纯化的HIS-Hp作为包被抗原进行间接ELISA检测,通过淋巴细胞杂交瘤技术筛选阳性细胞株,制备单克隆抗体。结果表明筛选到2株高效分泌抗猪Hp单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3B4和3C8。Western-blot和间接ELISA检测均表明制备的单克隆抗体具有良好的特异性。

关键词：猪结合珠蛋白基因克隆原核表达单克隆抗体

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鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的克隆与表达

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中国兽医学报 2008年第1期28卷 20-23页

作者：周祖涛陈芬芬李自力胡思顺孙淑娜吴仁蔚肖运才许青荣毕丁仁华中农业大学动物医学院湖北省预防兽医学重点实验室湖北武汉430070

利用本实验室分离、鉴定并保存的鸭疫里默氏杆菌血清1型湖北云梦分离株(RA-YM),根据GenBank上的序列设计了1对引物,用PCR方法扩增了RA-YM株的主要外膜蛋白OmpA基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果表明OmpA基因全长1152bp,序列同源性... 详细信息

利用本实验室分离、鉴定并保存的鸭疫里默氏杆菌血清1型湖北云梦分离株(RA-YM),根据GenBank上的序列设计了1对引物,用PCR方法扩增了RA-YM株的主要外膜蛋白OmpA基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果表明OmpA基因全长1152bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与其他不同RA菌株OmpA基因之间的核苷酸序列同源性为93%～97%。用pGEX-KG构建了原核表达载体pKG-OmpA,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的30%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白大小约为68000,Western-blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。

关键词：鸭疫里默氏杆菌 OmpA基因克隆原核表达

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表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建

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畜牧兽医学报 2007年第1期38卷 53-58页

作者：李自力陈焕春徐高原方六荣肖少波王祥何启盖华中农业大学动物医学院湖北省预防兽医学重点实验室武汉430070 湖北省公安厅武汉430034

本研究以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株基因组RNA为模板,采用RT-PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA(558 bp),用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物,回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中,获得了转... 详细信息

本研究以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株基因组RNA为模板,采用RT-PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA(558 bp),用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物,回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中,获得了转移载体pPgG-PrM,并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明:与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较,PrM基因的同源性为100%。以伪狂犬病病毒Ea株TK-/gG-/LacZ+突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK-/gG-/PrM+,为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。

关键词：乙型脑炎病毒 PrM基因重组伪狂犬病病毒

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禽流感灭活疫苗对商品肉鸭免疫效果的评价

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湖北农业科学 2007年第6期46卷 963-965页

作者：胡思顺郭锐刘梅肖运才李自力许青荣李东毕丁仁华中农业大学动物医学院/湖北省预防兽医学重点实验室武汉430070

为了了解和掌握商品肉鸭高致病性禽流感疫苗的免疫效果,对不同日龄的商品肉鸭进行了免疫试验。结果表明,3～10日龄时(H组)免疫,可以有效地刺激肉鸭产生禽流感HI抗体,并一直持续到40日龄;但由于母源抗体的干扰,在20日龄前后5～7 d,是一... 详细信息

为了了解和掌握商品肉鸭高致病性禽流感疫苗的免疫效果,对不同日龄的商品肉鸭进行了免疫试验。结果表明,3～10日龄时(H组)免疫,可以有效地刺激肉鸭产生禽流感HI抗体,并一直持续到40日龄;但由于母源抗体的干扰,在20日龄前后5～7 d,是一段易感染的免疫空白期。建议每年禽流感的免疫预防须提前到10月中上旬进行,以使侯鸟南飞迁徙时,所有家养水禽有充足的时间产生免疫力。

关键词：禽流感商品肉鸭免疫预防

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副猪嗜血杆菌Flp-FRT双基因敲除方法的建立与优化

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畜牧兽医学报 2022年第1期53卷 219-230页

作者：肖静肖坤雪王翘楚陈焕春蔡旭旺徐晓娟华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北省预防兽医学重点实验室武汉430070

本研究旨在利用Flp-FRT位点特异性重组系统建立副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis)的无抗性标记基因敲除方法,为***的毒力因子、致病机制和基因工程疫苗研究提供有力的遗传操作工具。首先利用λ噬菌体cI857/P_(RM)/P_(R)基因表达调控... 详细信息

本研究旨在利用Flp-FRT位点特异性重组系统建立副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis)的无抗性标记基因敲除方法,为***的毒力因子、致病机制和基因工程疫苗研究提供有力的遗传操作工具。首先利用λ噬菌体cI857/P_(RM)/P_(R)基因表达调控系统调控Flp重组酶的表达,实现抗性突变体中抗性基因的消除;然后将Flp表达质粒电转化引入*** CF7066,再自然转化介导同源重组的自杀性质粒获得有抗性标记的基因缺失突变株,调节Flp酶表达并筛选无抗突变株,提高培养温度消除表达Flp酶的温敏质粒;进一步通过筛选突变FRT位点以保证基因敲除的效率。结果表明成功构建了温敏穿梭质粒pSHG5C-Flp,证实了λcI857/P_(RM)/P_(R)表达系统可调控Flp重组酶在***中表达并切除抗性突变株ΔnanH::Kan_(R)中的抗性基因;然后用Flp重组酶表达质粒pSHG5C-Flp电转化*** CF7066,再用自杀性质粒pKF-ΔnanH和pKF-Δapd2对其进行两次连续自然转化,依次在自然转化的初代转化子中筛选并获得了无抗的单基因缺失株ΔnanH和双基因缺失株ΔnanHΔapd,提高培养温度至42℃培养消除了Flp重组酶表达质粒。尽管该系统实现了***两个基因的连续敲除,但敲除第2个基因时的效率明显下降,这很可能源于细菌细胞中Flp重组酶表达的积累,对转化质粒介导的同源重组产生了干扰。因此,作者筛选了突变的FRT位点、构建自杀性质粒pKFM-Δapd进行自然转化,显著提高了自然转化后获得突变株的效率,从而保证了该敲除系统的有效性和稳定性。本研究首次报道了可用于***的无抗性标记双基因缺失突变系统,为其分子致病基因与基因工程疫苗的研究奠定了基础。

关键词：副猪嗜血杆菌表达调控 Flp-FRT 基因敲除无抗缺失

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猪流产嗜性衣原体POMP90蛋白的原核表达及反应原性分析

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华中农业大学学报 2008年第4期27卷 491-494页

作者：梅仕林孟宪荣栗绍文何诚杨琪喻翠翠张望毕丁仁华中农业大学湖北省预防兽医学重点实验室武汉430070 中国农业大学动物医学院北京100094

设计特异性引物进行PCR扩增,获得猪流产嗜性衣原体CP/12株的pomp90基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-KG中。阳性重组质粒转化原核表达宿主菌***21,用IPTG进行诱导表达,获得高效表达的融合蛋白。采用Western-blot和间接ELISA检测表... 详细信息

设计特异性引物进行PCR扩增,获得猪流产嗜性衣原体CP/12株的pomp90基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-KG中。阳性重组质粒转化原核表达宿主菌***21,用IPTG进行诱导表达,获得高效表达的融合蛋白。采用Western-blot和间接ELISA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的反应原性,初步选择其最佳包被浓度为1μg/mL。

关键词：猪流产嗜性衣原体 POMP90蛋白原核表达反应原性

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