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生物技术进展 2021年第4期11卷 471-475页

作者：王子健陈颖钰胡长敏郭爱珍华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 华中农业大学动物医学院武汉430070

兽用诊断试剂产业服务于动物疾病防控的技术需求,既是一个独立的产业,也是多学科交叉、技术密集、资金密集型产业。和国际兽用诊断试剂产业相比,我国兽用诊断试剂产业起步晚,底子薄,产品质量差距明显。通过对比和分析兽用诊断试剂产业... 详细信息

兽用诊断试剂产业服务于动物疾病防控的技术需求,既是一个独立的产业,也是多学科交叉、技术密集、资金密集型产业。和国际兽用诊断试剂产业相比,我国兽用诊断试剂产业起步晚,底子薄,产品质量差距明显。通过对比和分析兽用诊断试剂产业的国内外现状,提出了我国兽用诊断试剂行业所面临的挑战,指出了未来的发展趋势,以期为我国兽用诊断试剂产业的发展提供有益的参考建议。

关键词：兽用诊断试剂检测技术动物疾病防控

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捻转血矛线虫部分发育相关基因功能的研究

捻转血矛线虫部分发育相关基因功能的研究

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2021中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第16次学术研讨会

作者：胡敏李法财何莉邸文达李芳芳农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院

寄生线虫感染性三期阶段(iL3)在形态生理生化等方面都与自由生活的秀丽新杆线虫滞育期幼虫(Dauer)相似,因此有人提出调控iL3和Dauer发育的分子机制也应该相似的"Dauer假说"。调控秀丽新杆线虫Dauer发育的分子机制了解得比较透... 详细信息

寄生线虫感染性三期阶段(iL3)在形态生理生化等方面都与自由生活的秀丽新杆线虫滞育期幼虫(Dauer)相似,因此有人提出调控iL3和Dauer发育的分子机制也应该相似的"Dauer假说"。调控秀丽新杆线虫Dauer发育的分子机制了解得比较透彻,而对大部分寄生线虫iL3的发育调控机制仍然所知甚少。本课题组自2010年开始探索捻转血矛线虫iL3发育调控分子机制研究,利用RACE-PCR、RT-PCR、异源转基因技术、蛋白质表达、免疫间接荧光方法、体外RNA干扰技术及体外抑制剂实验对该虫胰岛素和TGF-β信号传导通路中的重要基因进行了鉴定及功能研究。结果发现胰岛素信号通路重要基因在氨基酸序列、时空表达特征及功能方面与秀丽新杆线虫同源分子相似性高,而TGF-β信号传导通路中重要基因与秀丽新杆线虫同源分子的相似性较低。研究结果支持Dauer假说,但是同时提示捻转血矛线虫iL3的发育调控机制仍然在一些方面与秀丽新杆线虫Dauer的发育调控机制不同,需要进行更深入的研究。本研究建立了一系列技术方法,其发现增加了对捻转血矛线虫iL3发育相关基因功能的认识,为进一步研究调控机制奠定了良好的基础。由于捻转血矛线虫遗传操作系统的缺乏极大阻碍了对其分子调控机制的深入探索,今后需要建立更好的技术平台以阐明体内寄生阶段发育调控机制。

关键词：捻转血矛线虫感染期幼虫发育基因功能调控机制

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猪δ冠状病毒激活未折叠蛋白反应的分子机制

猪δ冠状病毒激活未折叠蛋白反应的分子机制

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中国微生物学会兽医微生物学专业委员会暨中国畜牧兽医学会生物制品学分会2021年学术论坛

作者：方谱县田丽园方六荣肖少波华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物医学院

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年来发现的一种重要肠道冠状病毒,感染仔猪可引发腹泻、呕吐、脱水甚至死亡,而且具有跨种感染潜能。自2014年PDCoV首次在美国爆发以来,目前已有10多个国家或地区报道了PDCoV的发生与流...

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年来发现的一种重要肠道冠状病毒,感染仔猪可引发腹泻、呕吐、脱水甚至死亡,而且具有跨种感染潜能。自2014年PDCoV首次在美国爆发以来,目前已有10多个国家或地区报道了PDCoV的发生与流行,严重威胁养猪业发展。内质网(ER)是细胞内蛋白质合成、加工、成熟以及运输的主要场所,参与各种信号通路的调控以维持细胞稳态。病毒感染常常导致大量的未折叠蛋白或折叠异常的蛋白积累,从而引起内质网应激(ER stress)。为了维持内质网稳态,细胞常常激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)应对内质网应激;同时,某些病毒也可操控细胞的UPR,促进自身复制。目前,关于PDCoV感染是否激活UPR以及如何激活尚不清楚。本研究系统分析了PDCoV感染LLC-PK1细胞(猪肾上皮细胞)和IPI-2I细胞(猪小肠上皮细胞)后UPR的3条信号通路(PERK、ATF6、IREI)的激活情况,发现PDCoV感染促进切割形式的XBP1s的表达、显著上调eIF2α的磷酸化水平,但对GRP78、GRP94、Calreticulin以及转录因子p50ATF6蛋白的表达没有影响,提示PDCoV感染激活了IRE1和PERK信号通路,但不激活ATF6信号途径。进一步通过药物处理、RNA干扰以及超表达实验,证实PDCoV激活IRE1和PERK信号通路有利于病毒复制。为了确定PDCoV编码的哪种蛋白在激活UPR中发挥重要作用,分析了PDCoV编码的所有结构蛋白和非结构蛋白,发现辅助蛋白NS6能激活UPR,而且可同时激活IRE1、PERK、ATF6三条通路。利用建立的PDCoV AJ1102株感染性克隆,借助CRISPR/Cas9技术,分别构建了NS6完全缺失、EGFP置换NS6的重组病毒,发现与同样采用感染性克隆拯救的PDCoV AJ1102野生型病毒相比,NS6缺失或EGFP置换的重组PDCoV激活IRE1和PERK信号途径的能力显著降低,从病毒水平进一步证实了NS6在诱导内质网应激中发挥主要作用,为阐明PDCoV的致病机制、挖掘潜在的药物靶标奠定了基础。

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神农架金丝猴常见疾病的流行病学调查及风险因素分析

神农架金丝猴常见疾病的流行病学调查及风险因素分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十九次全国学术研讨会

作者：祁明普汪乾坤陈颖钰胡长敏杨万吉姚辉李翔陈建国 Ian Duncan Robertson 陈焕春郭爱珍农业微生物学国家重点实验室动物医学院华中农业大学

引言川金丝猴为国家一级保护动物,是我国特有的珍稀濒危动物,有"第二国宝"的美称。其栖息地主要分布在湖北等地区,而湖北的金丝猴主要分布在神农架自然保护区[1]。目前神农架约有1,400只金丝猴。据报道,大量疾病如腺病毒病(A...

引言川金丝猴为国家一级保护动物,是我国特有的珍稀濒危动物,有"第二国宝"的美称。其栖息地主要分布在湖北等地区,而湖北的金丝猴主要分布在神农架自然保护区[1]。目前神农架约有1,400只金丝猴。据报道,大量疾病如腺病毒病(AdV)、甲肝病毒病(HAV)、B病毒病(BV)、柯萨奇病毒病(CV)、猴病毒40病(SV40)、麻疹病毒病(MV)、轮状病毒病(RV)和结核病(***)等威胁着灵长类动物生存和健康。更重要的是,有些灵长类疾病与

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牛分枝杆菌卡介苗fadD18基因功能的研究

牛分枝杆菌卡介苗fadD18基因功能的研究

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中国防痨协会第33届全国学术大会暨中国防痨科技奖颁奖大会

作者：苏莉李倩倩朱一帆郭爱珍陈颖钰华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物医学院

目的结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性人畜共患病,每年全球新发病例约有1000万,死亡人数上百万,给人类健康带来巨大威胁。致病机制不清、缺乏高效诊断、疫苗、药物耙点是导致结核病防控难的重要因素之... 详细信息

目的结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性人畜共患病,每年全球新发病例约有1000万,死亡人数上百万,给人类健康带来巨大威胁。致病机制不清、缺乏高效诊断、疫苗、药物耙点是导致结核病防控难的重要因素之一。为解决这一问题,本实验室以牛分支杆菌卡介苗为模式细菌,构建了随机插入突变体库,通过前期筛选发现了一株具有低侵袭能力的突变株;为确定该突变株及插入基因是否具有作为结核疫苗、药物靶点的潜在能力,我们对其进行了深入的研宄。方法本研究前期利用携带有Himarl的MycoMarT7转座子系统的噬菌体成功构建了牛分枝杆菌BCG随机突变体库。通过生物信息学KEGG/GO聚类分析以及侵袭模型对突变体库进行筛选,发现了一株具有低侵袭力表型的突变体B2909。通过转座子测序对该突变株所插入失活基因进行了确定。进一步的,为确定该突变体的功能,利用肺上皮细胞A549粘附模型对突变体的毒力进行了检测,并测定了该突变体的生长曲线、菌落形态以及胞内存活能力。此外,为了解突变体引起的炎性应答及其通路变化,将野生型BCG与突变株B2909以M0I为10:1的比例分别感染人THP-1巨噬细胞,通过qRT-PCR、ELISA以及Western blot方法,对炎性因子的mRNA和蛋白水平、信号通路磷酸化激活等情况进行检测。结果研宄结果显示,突变株B2909的突变基因为fadD18,主要编码脂肪酸辅酶A连接酶。与野生株相比,突变株B2909的侵袭及黏附能力显著降低,并具有单菌落变小、索状结构变少、生长速度变慢的生长表型,但颜色无明显改变。胞内存活结果表明,突变株B2909的胞内存活能力显著强于野生型BCG。此外,相比野生型BCG,在mRNA和蛋白表达水平上,突变株B2909能够显著降低炎性细胞因子IL-6和IL-Iβ的表达,而TNF-a虽然在mRNA水平上表达显著降低,但在蛋白水平上无显著性差异。对信号通路的Western blot检测结果显示,BCG突变株B2909能够显著抑制NF-kB和MAPK信号通路的激活。结论本研宄构建了牛分枝杆菌BCG全基因组突变体库,并利用侵袭模型筛选与鉴定BCG突变株B2909的突变基因为fadD18基因,发现该基因毒力降低,并能通过抑制NF-kB和MAPK信号通路激活从而降低巨噬细胞IL-6、IL-Iβ和TNF-a的表达最终促进胞内菌存活。本研宄的发现为进一步阐明结核分枝杆菌致病机制和免疫机理奠定了基础,为结核病疫苗的研发提供了重要靶标。

关键词： BCG突变体库 fadD18基因炎症应答胞内存活

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我国牛星状病毒流行病学调查和新型基因型的鉴定

我国牛星状病毒流行病学调查和新型基因型的鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十九次全国学术研讨会

作者：朱杰祁明普姜传文彭永崇彭清洁陈颖钰胡长敏陈建国陈曦陈焕春郭爱珍农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院

引言牛星状病毒(BoAstV)属于星状病毒科(AstV)哺乳动物星状病毒属(MAstV),目前该病毒在腹泻和健康犊牛的粪便中均可检测到[1]。然而该病毒在我国牛群中的流行率、遗传多样性以及与犊牛腹泻的关联了解甚少。材料与方法本研究采集了87份...

引言牛星状病毒(BoAstV)属于星状病毒科(AstV)哺乳动物星状病毒属(MAstV),目前该病毒在腹泻和健康犊牛的粪便中均可检测到[1]。然而该病毒在我国牛群中的流行率、遗传多样性以及与犊牛腹泻的关联了解甚少。材料与方法本研究采集了87份腹泻犊牛和77份无症状犊牛的粪便样本,这些样本分布在12个省份的20个养殖场。通过RT-PCR检测样本中的BoAstV,对阳性样本进行下一代测序(NGS)获得BoAstV的全基因组,并利用生物信息学软件对获得的序列进行遗传进化、重组等分析。

关键词：

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猪δ冠状病毒感染切割智力障碍相关蛋白TRMT

猪δ冠状病毒感染切割智力障碍相关蛋白TRMT

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中国微生物学会兽医微生物学专业委员会暨中国畜牧兽医学会生物制品学分会2021年学术论坛

作者：陈霁瑶李壮方六荣肖少波华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物医学院

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的肠道冠状病毒,不仅感染猪,而且还可感染鸡、火鸡、牛等其它动物;最近,美国学者报道从三名患有急性发热性疾病的海地儿童的血浆样本中检测到PDCoV的全基因组,提示PDCoV具有...

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的肠道冠状病毒,不仅感染猪,而且还可感染鸡、火鸡、牛等其它动物;最近,美国学者报道从三名患有急性发热性疾病的海地儿童的血浆样本中检测到PDCoV的全基因组,提示PDCoV具有感染人的可能。冠状病毒的非结构蛋白nsp5是一种3C样蛋白酶,负责病毒多聚蛋白前体的切割,对病毒的复制至关重要。同时,nsp5还可切割大量的宿主蛋白,发挥免疫调节功能。因此,冠状病毒的nsp5常常作为筛选抗病毒药物的靶点。本实验室在前期研究中,发现PDCoV nsp5可切割宿主细胞的NEMO (Virology,2016)、STAT2 (J Virol,2017)、DCPla (J Virol,2020),从而拮抗干扰素产生、信号转导以及ISG的抗病毒作用;同时,还发现PDCoV nsp5可切割TRMT1、HDAC2等宿主蛋白。TRMT1蛋白是一种能导致tRNA特定位置发生甲基化修饰(m2,2G)的甲基转移酶,该蛋白某些位点的突变可导致常染色体隐性智力障碍。目前,关于PDCoV nsp5切割TRMT1的分子细节及其生物学意义尚不清楚。本研究首先利用CO-IP验证了PDCoV nsp5及其蛋白酶活性突变体C144A均能与猪源TRMT1存在相互作用,但nsp5 C144A不能切割TRMT1,说明nsp5切割TRMT1依赖于其蛋白酶活性;同时,在PDCoV感染LLC-PK1后,可检测到内源性TRMT1的切割。通过构建猪源TRMT1的一系列突变体,证实PDCoV nsp5切割猪源TRMT1的位点为Q504位。有意义的是,PDCoV nsp5也可以切割人源TRMT1。进一步比较分析了PEDV、229E、MHV、HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、PDCoV等8种冠状病毒nsp5,发现只有SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、PDCoV的nsp5可切割TRMT1。鉴于PDCoV具有感染人的可能,而且TRMT1又是一种与智力障碍相关的分子,研究切割TRMT1的生物学意义有望揭示冠状病毒nsp5的新功能。目前已经构建TRMT1 knockout细胞系,正对其切割产物是否丧失修饰tRNA的能力进行深入研究。

关键词：

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捻转血矛线虫三期到四期发育阶段体外培养条件初探

捻转血矛线虫三期到四期发育阶段体外培养条件初探

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2021中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第16次学术研讨会

作者：刘璐王春群周彩显瓦热斯刘慧刘峰叶丽莎张耀胡敏农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院

捻转血矛线虫是寄生于反刍动物皱胃的吸血性寄生线虫,常导致宿主腹泻、消瘦、贫血甚至死亡,给牛羊养殖业带来巨大的经济损失。近年来关于其抗药性的文章在多地均有报道,因此急需挖掘新的药物靶标和疫苗候选抗原。由于缺乏可用的体外遗... 详细信息

捻转血矛线虫是寄生于反刍动物皱胃的吸血性寄生线虫,常导致宿主腹泻、消瘦、贫血甚至死亡,给牛羊养殖业带来巨大的经济损失。近年来关于其抗药性的文章在多地均有报道,因此急需挖掘新的药物靶标和疫苗候选抗原。由于缺乏可用的体外遗传操作系统,这些重要分子功能的研究受到极大限制。本研究旨在探索体外培养从感染性三期到寄生性四期阶段的虫体,以建立适合其发育的体外培养系统。多年来捻转血矛线虫的体外培养一直停滞于寄生阶段的四期早期,即相当于体内感染后的2天左右,本研究配置了一种新型的混合培养基使脱鞘三期幼虫在体外培养20天后,与感染后体内发育4-6天相似。在此培养系统中,幼虫体长达900μm,体宽达30μm;生殖原基由两个细胞发育至12个细胞左右;肠道发育为管状;可以初步区分雌雄虫。通过提高新型培养基中脱纤维蛋白血的含量,在体外培养20天后,20%幼虫发育至与体内8天幼虫相似。此时可以清晰的观测到生殖系统各部分器官,雌虫各器官清晰可辨;并与消化系统交互缠绕。本体外培养系统可使四期早期在体外发育至四期中后期,在前人培养系统的基础上有了长足的进步,为日后完成完整的寄生阶段虫体的体外培养系统打下了初步的基础。

关键词：捻转血矛线虫体外培养混合培养基红细胞

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捻转血矛线虫伊维菌素敏感株和耐药株抗药性相关基因转录组分析

捻转血矛线虫伊维菌素敏感株和耐药株抗药性相关基因转录组分析

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2021中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第16次学术研讨会

作者：瓦热斯周彩显覃裴溪王春群刘璐刘慧胡敏农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是一种严重危害反刍动物的胃肠道线虫,呈全球性分布。由于缺乏商业化疫苗,控制捻转血矛线虫病主要依靠抗蠕虫药,而长期无节制的抗蠕虫药的使用导致在全球范围内都出现了抗药性的问题,其中伊维菌素抗... 详细信息

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是一种严重危害反刍动物的胃肠道线虫,呈全球性分布。由于缺乏商业化疫苗,控制捻转血矛线虫病主要依靠抗蠕虫药,而长期无节制的抗蠕虫药的使用导致在全球范围内都出现了抗药性的问题,其中伊维菌素抗药性较为严重且分布广泛。转录组学作为新兴的"组学"研究技术,能够从整体水平了解特定生物学发生发展过程及调控机制。因此,为了更好的探明捻转血矛线虫伊维菌素耐药株和敏感株在转录组水平上的差异及挖掘抗药机制相关的基因,本研究选取耐药株和敏感株的雌雄成虫进行转录组学研究,测定构建的cDNA文库的序列并进行生物信息学分析;在此基础上,利用荧光定量PCR验证部分差异表达基因。结果显示,耐药组与敏感组相比较共获得雄虫组543和雌虫组359个显著(P≤0.05)差异表达基因,包括338和105个基因分别在雄虫组和雌虫组上调,而205和254个基因分别在雄虫组和雌虫组下调。对各组显著差异表达基因进行GO分析,发现代谢过程,细胞过程,膜和膜部分,催化活性、转运活性及结合等富集水平最高。KEGG信号通路分析表明,差异表达基因被富集到细胞凋亡、溶酶体、自噬、鞘脂信号通路、药物代谢-其他酶及MAPK等信号通路上。本研究利用RNA-seq初步分析了耐药株和敏感株雌雄虫的差异表达基因,为进一步挖掘出耐药相关基因奠定了良好的基础。

关键词：捻转血矛线虫伊维菌素抗药性转录组学

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转血矛线虫感染性三期幼虫及雌雄性成虫环状RNA的初步研究

转血矛线虫感染性三期幼虫及雌雄性成虫环状RNA的初步研究

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2021中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第16次学术研讨会

作者：周彩显刘慧张耀伍思敏王春群瓦热斯刘峰叶莉莎王志恒胡敏农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院

环状RNA是一类不具有3’端尾巴和5’端帽子的内源性非编码RNA分子,具有重要的生物学功能,如充当miRNA海绵,影响下游蛋白的翻译;与RNA聚合酶Ⅱ结合,然后与U1 snRNP相互作用,促进其亲本基因的转录;有的环状RNA甚至还可以翻译为多肽,具有... 详细信息

环状RNA是一类不具有3’端尾巴和5’端帽子的内源性非编码RNA分子,具有重要的生物学功能,如充当miRNA海绵,影响下游蛋白的翻译;与RNA聚合酶Ⅱ结合,然后与U1 snRNP相互作用,促进其亲本基因的转录;有的环状RNA甚至还可以翻译为多肽,具有重要的研究价值。目前已在动物和植物中有所研究,如人、小鼠、果蝇、拟南芥等,然而线虫领域仅局限于自由生活的秀丽隐杆线虫。本研究以捻转血矛线虫感染性三期及雌雄性成虫为研究对象,构建了链特异性文库,共鉴定到20073个环状RNA,71%的由外显子组成,X染色体上的分布最丰富,41%的亲本基因只能产生一个环状RNA。差异表达环状RNA主要富集于代谢通路（如丙酮酸代谢、甘油磷脂代谢）、MAPK信号通路、磷脂酰肌醇信号通路,提示环状RNA可能在虫体的信号传导及生长发育阶段中发挥作用。预测环状RNA与miRNA的结合位点,发现环状RNA（hcoirc0015227）与hco-miR-307有10个结合位点,可能为潜在的分子海绵。成功验证测序数据准确性及环状RNA对RNase R的耐受性,并通过设计离散型引物成功验证了24个候选环状RNA的环化剪切位点。综上所述,本研究首次获得捻转血矛线虫不同发育阶段/性别中环状RNA的全面表达谱,为研究环状RNA的功能提供数据基础,也有助于进一步了解环状RNA在寄生性线虫中的作用。

关键词：捻转血矛线虫环状RNA 高通量测序 miRNA海绵

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